【摘要】：目的:同卵雙生子(monozygotic twins,MZT)的鑒別依然是法醫(yī)學未解難題。本課題組對此進行系列研究,構建了一組包含9個序列37個CpG位點的DNA甲基化檢測體系,對120對MZT進行研究,以MZT之間甲基化水平差值大于5%作為閾值,區(qū)分MZT個體的能力達到94.20%;以10%為閾值時,區(qū)分能力為55.33%。為進一步評價該體系的法醫(yī)學實際應用價值,本課題對該體系進行靈敏度、穩(wěn)定性、組織一致性、模擬法醫(yī)實際檢材等研究。方法:采集26對MZT(0~80歲)外周血,驗證MZT的檢測體系區(qū)分MZT個體的效能。采集20名健康成年無關個體不同時期外周血樣本,采樣間隔3個月,時間跨度9個月,共采樣4次,驗證時間穩(wěn)定性。采取3例尸檢個體的心臟、肝臟、腎臟、和腦組織樣本,評價組織一致性。比較兩個亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒的轉(zhuǎn)化回收率,設置不同濃度轉(zhuǎn)化后DNA進行靈敏度研究。取3名成年無關個體指尖血制備的血痕、口腔拭子及2根含毛囊的頭發(fā),評價檢測體系對法醫(yī)實際檢材的應用價值。應用E.Z.N.A Blood DNA Midi kit(OMEGA Bio-Tek)提取血液樣本的基因組DNA;應用QIAamp DNA Investigator Kit(Qiagen)試劑盒提取頭發(fā)、口腔拭子、血卡和組織的基因組DNA。DNA經(jīng)EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO)和EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(Qiagen)進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,以轉(zhuǎn)化后的DNA為模板,擴增LINE-1、GS1、GS3、IGS1、IGS2、IGS3、IGS4、IGS5、IGS6九條靶序列,對擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序,獲得9條序列37個CpG位點甲基化水平的定量數(shù)據(jù)。應用Excel、SPSS 24.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析。結果:在研究的132份血液樣本中,LINE-1、GS1、GS3、IGS1、IGS2、IGS3、IGS、IGS5、IGS6序列的平均甲基化水平為61.68%、91.23%、91.45%、76.26%、75.45%、84.05%、80.86%、74.21%、82.52%。26對MZT測試樣本的結果表明,在甲基化差異閾值為5%和10%的條件下,九條序列區(qū)分MZT的數(shù)量分別為22對(84.62%)和10對(38.46%),與前期研究中訓練樣本結果無統(tǒng)計學差異。時間穩(wěn)定性結果表明,在20名成年無關個體時間跨度9個月間隔3個月的4個血液樣本間,同一個體九條序列的甲基化程度均無明顯差異,證實其在相對較短時間內(nèi)具有穩(wěn)定性。但比較一對MZT間隔7年的甲基化程度,發(fā)現(xiàn)只有基因區(qū)三條序列LINE-1,GS1和GS3的DNA甲基化程度未發(fā)生明顯變化,而基因間區(qū)六條序列IGS1、IGS2、IGS3、IGS4、IGS5、IGS6都表現(xiàn)出隨著時間的推移,DNA甲基化水平明顯降低。組織一致性檢測結果表明,在心、肝、腎和腦4種組織樣本,LINE-1、IGS1、IGS5和IGS6序列未表現(xiàn)出DNA甲基化差異,但GS1、GS3、IGS2、IGS3和IGS4這五條序列甲基化程度存在明顯差異。GS1序列在肝組織的DNA甲基化程度高于其它三種組織,IGS3序列在腦組織的DNA甲基化程度低于其它三種組織,DNA甲基化差值40%。靈敏度研究結果發(fā)現(xiàn),EZ DNA Methylation-Gold Kit和EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit的平均轉(zhuǎn)化回收率分別為74.24%和64.76%;序列LINE-1,GS1,GS3,IGS1和IGS2,在轉(zhuǎn)化后DNA為5 ng時,可以得到可靠的結果,序列IGS3,IGS4,IGS5和IGS6在轉(zhuǎn)化后DNA為10 ng時,可以得到可靠的結果。對法醫(yī)模擬檢材進行研究,發(fā)現(xiàn)血痕、口腔拭子和毛發(fā)三種檢材均可檢出九條靶序列的DNA甲基化水平,但GS1、IGS2、IGS4和IGS5這四條序列在三種檢材的甲基化程度有明顯差異。結論:對焦磷酸測序技術構建的九條序列DNA甲基化檢測體系進行法醫(yī)學應用評估,證實該體系對同卵雙生子具有一定的區(qū)分能力;九條序列的甲基化在一年時間內(nèi)具有相對穩(wěn)定性,基因區(qū)序列在7年內(nèi)也很穩(wěn)定,但基因間區(qū)序列表現(xiàn)出明顯差異;GS1、GS3、IGS2、IGS3和IGS4五條序列的DNA甲基化具有組織差異性,其余四條序列未表現(xiàn)出明顯的組織差異性;對于血痕、口腔拭子和毛發(fā)三種常見法醫(yī)檢材,均可獲得準確結果,檢測的最低濃度在5 ng至10 ng之間變化,具體取決于序列。檢測靈敏度可滿足常量法醫(yī)檢材,具有一定的法醫(yī)學應用價值。檢測體系鑒別MZT的能力及靈敏度尚需進一步提高。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：D919.4
【圖文】：

17圖 1 LINE-1 靶序列及其引物序列Fig.1 LINE-1 target sequence, bisulfite conversion sequence, primersequences and the target CpG sites. Sequences in gray box are PCR primers,sequence in yellow box is sequencing primer, sequences in blue box are thetarget CpG sites.

圖 2 GS1 靶序列及其引物序列Fig.2 GS1 target sequence, bisulfite conversion sequence, primer sequencesand the target CpG sites. Sequences in gray box are PCR primers, sequence inyellow box is sequencing primer, sequences in blue box are the target CpGsites.

圖 3 GS3 靶序列及其引物序列Fig.3 GS3 target sequence, bisulfite conversion sequence, primer sequenceand the target CpG sites. Sequences in gray box are PCR primers, sequence inyellow box is sequencing primer, sequences in blue box are the target CpGsites.

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 李淑瑾;關亞卿;張賀玲;付麗紅;張曉靜;馬春玲;叢斌;;1對同卵雙生新生兒DNA甲基化譜差異分析[J];中國法醫(yī)學雜志;2012年04期

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1 張倩;甄別同卵雙生子的DNA甲基化序列篩選研究[D];河北醫(yī)科大學;2017年

本文編號：2785462