發(fā)布時(shí)間：2020-08-08 10:44

【摘要】：目的:同卵雙生子(monozygotic twins,MZT)的鑒別依然是法醫(yī)學(xué)未解難題。本課題組對(duì)此進(jìn)行系列研究,構(gòu)建了一組包含9個(gè)序列37個(gè)CpG位點(diǎn)的DNA甲基化檢測體系,對(duì)120對(duì)MZT進(jìn)行研究,以MZT之間甲基化水平差值大于5%作為閾值,區(qū)分MZT個(gè)體的能力達(dá)到94.20%;以10%為閾值時(shí),區(qū)分能力為55.33%。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)該體系的法醫(yī)學(xué)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,本課題對(duì)該體系進(jìn)行靈敏度、穩(wěn)定性、組織一致性、模擬法醫(yī)實(shí)際檢材等研究。方法:采集26對(duì)MZT(0~80歲)外周血,驗(yàn)證MZT的檢測體系區(qū)分MZT個(gè)體的效能。采集20名健康成年無關(guān)個(gè)體不同時(shí)期外周血樣本,采樣間隔3個(gè)月,時(shí)間跨度9個(gè)月,共采樣4次,驗(yàn)證時(shí)間穩(wěn)定性。采取3例尸檢個(gè)體的心臟、肝臟、腎臟、和腦組織樣本,評(píng)價(jià)組織一致性。比較兩個(gè)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒的轉(zhuǎn)化回收率,設(shè)置不同濃度轉(zhuǎn)化后DNA進(jìn)行靈敏度研究。取3名成年無關(guān)個(gè)體指尖血制備的血痕、口腔拭子及2根含毛囊的頭發(fā),評(píng)價(jià)檢測體系對(duì)法醫(yī)實(shí)際檢材的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用E.Z.N.A Blood DNA Midi kit(OMEGA Bio-Tek)提取血液樣本的基因組DNA;應(yīng)用QIAamp DNA Investigator Kit(Qiagen)試劑盒提取頭發(fā)、口腔拭子、血卡和組織的基因組DNA。DNA經(jīng)EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO)和EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(Qiagen)進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,以轉(zhuǎn)化后的DNA為模板,擴(kuò)增LINE-1、GS1、GS3、IGS1、IGS2、IGS3、IGS4、IGS5、IGS6九條靶序列,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序,獲得9條序列37個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平的定量數(shù)據(jù)。應(yīng)用Excel、SPSS 24.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:在研究的132份血液樣本中,LINE-1、GS1、GS3、IGS1、IGS2、IGS3、IGS、IGS5、IGS6序列的平均甲基化水平為61.68%、91.23%、91.45%、76.26%、75.45%、84.05%、80.86%、74.21%、82.52%。26對(duì)MZT測試樣本的結(jié)果表明,在甲基化差異閾值為5%和10%的條件下,九條序列區(qū)分MZT的數(shù)量分別為22對(duì)(84.62%)和10對(duì)(38.46%),與前期研究中訓(xùn)練樣本結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。時(shí)間穩(wěn)定性結(jié)果表明,在20名成年無關(guān)個(gè)體時(shí)間跨度9個(gè)月間隔3個(gè)月的4個(gè)血液樣本間,同一個(gè)體九條序列的甲基化程度均無明顯差異,證實(shí)其在相對(duì)較短時(shí)間內(nèi)具有穩(wěn)定性。但比較一對(duì)MZT間隔7年的甲基化程度,發(fā)現(xiàn)只有基因區(qū)三條序列LINE-1,GS1和GS3的DNA甲基化程度未發(fā)生明顯變化,而基因間區(qū)六條序列IGS1、IGS2、IGS3、IGS4、IGS5、IGS6都表現(xiàn)出隨著時(shí)間的推移,DNA甲基化水平明顯降低。組織一致性檢測結(jié)果表明,在心、肝、腎和腦4種組織樣本,LINE-1、IGS1、IGS5和IGS6序列未表現(xiàn)出DNA甲基化差異,但GS1、GS3、IGS2、IGS3和IGS4這五條序列甲基化程度存在明顯差異。GS1序列在肝組織的DNA甲基化程度高于其它三種組織,IGS3序列在腦組織的DNA甲基化程度低于其它三種組織,DNA甲基化差值40%。靈敏度研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),EZ DNA Methylation-Gold Kit和EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit的平均轉(zhuǎn)化回收率分別為74.24%和64.76%;序列LINE-1,GS1,GS3,IGS1和IGS2,在轉(zhuǎn)化后DNA為5 ng時(shí),可以得到可靠的結(jié)果,序列IGS3,IGS4,IGS5和IGS6在轉(zhuǎn)化后DNA為10 ng時(shí),可以得到可靠的結(jié)果。對(duì)法醫(yī)模擬檢材進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)血痕、口腔拭子和毛發(fā)三種檢材均可檢出九條靶序列的DNA甲基化水平,但GS1、IGS2、IGS4和IGS5這四條序列在三種檢材的甲基化程度有明顯差異。結(jié)論:對(duì)焦磷酸測序技術(shù)構(gòu)建的九條序列DNA甲基化檢測體系進(jìn)行法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評(píng)估,證實(shí)該體系對(duì)同卵雙生子具有一定的區(qū)分能力;九條序列的甲基化在一年時(shí)間內(nèi)具有相對(duì)穩(wěn)定性,基因區(qū)序列在7年內(nèi)也很穩(wěn)定,但基因間區(qū)序列表現(xiàn)出明顯差異;GS1、GS3、IGS2、IGS3和IGS4五條序列的DNA甲基化具有組織差異性,其余四條序列未表現(xiàn)出明顯的組織差異性;對(duì)于血痕、口腔拭子和毛發(fā)三種常見法醫(yī)檢材,均可獲得準(zhǔn)確結(jié)果,檢測的最低濃度在5 ng至10 ng之間變化,具體取決于序列。檢測靈敏度可滿足常量法醫(yī)檢材,具有一定的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。檢測體系鑒別MZT的能力及靈敏度尚需進(jìn)一步提高。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：D919.4
【圖文】：

17圖 1 LINE-1 靶序列及其引物序列Fig.1 LINE-1 target sequence, bisulfite conversion sequence, primersequences and the target CpG sites. Sequences in gray box are PCR primers,sequence in yellow box is sequencing primer, sequences in blue box are thetarget CpG sites.

圖 2 GS1 靶序列及其引物序列Fig.2 GS1 target sequence, bisulfite conversion sequence, primer sequencesand the target CpG sites. Sequences in gray box are PCR primers, sequence inyellow box is sequencing primer, sequences in blue box are the target CpGsites.

圖 3 GS3 靶序列及其引物序列Fig.3 GS3 target sequence, bisulfite conversion sequence, primer sequenceand the target CpG sites. Sequences in gray box are PCR primers, sequence inyellow box is sequencing primer, sequences in blue box are the target CpGsites.

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李淑瑾;關(guān)亞卿;張賀玲;付麗紅;張曉靜;馬春玲;叢斌;;1對(duì)同卵雙生新生兒DNA甲基化譜差異分析[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2012年04期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張倩;甄別同卵雙生子的DNA甲基化序列篩選研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2785462