【摘要】：研究背景核能與核技術(shù)已廣泛應(yīng)用于工業(yè)、國防和醫(yī)療等領(lǐng)域。但是核事故、核泄漏等帶來的電離輻射損傷相關(guān)醫(yī)學(xué)問題一直是公眾關(guān)注的問題,不少方面還未找到很好的解決辦法。輻射致癌就是其中之一,它是電離輻射導(dǎo)致的遠(yuǎn)期效應(yīng),發(fā)生機(jī)制不明,早期監(jiān)測、早期干預(yù)和特異性治療手段都非常有限,眾多難題尚未研究解決,亟需從新的途徑不斷探索輻射致癌的分子機(jī)制,尋找新的靶向分子,為早期監(jiān)測、早期干預(yù)和特異性的治療提供新理論、新思路。miRNA在生物體的發(fā)育、增殖、分化、凋亡、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等方面的作用已有諸多報(bào)道,但在輻射致癌中的作用卻關(guān)注較少。為此,我們課題組在前期開展了輻射致癌與miRNA關(guān)系的研究,并首次報(bào)道了數(shù)條miRNA的作用,如miR-100,miR-467a,miR-200c和miR-21等,為miRNA與輻射致癌的研究提供了有益的借鑒。但是,隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)仍然存在許多重要的問題沒有解決,包括:1、輻射致癌中的關(guān)鍵miRNA仍未確認(rèn);2、單個(gè)miRNA的改變已很難完全解釋輻射致癌的發(fā)生機(jī)制,亟需從新的角度來闡述疾病的發(fā)生過程。這些難題的出現(xiàn),一方面是因?yàn)樯顒?dòng)的復(fù)雜性,另一方面也由于過去研究方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的局限性。對于miRNA而言,其主要是通過靶向目的基因的mRNA起作用,因此,構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)已成為近年來miRNA研究鄰域的一個(gè)重要熱點(diǎn)。Darnell,R.B等在2009的Nature雜志首先報(bào)道并提出了miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖(miRNA-mRNA interaction maps)概念。隨后,許多科學(xué)家利用miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò),開始從整體和“模塊”的角度研究腫瘤的特征,并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)重要的新靶點(diǎn),為腫瘤研究開辟了新的道路。這種基于miRNA篩選構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的方法具有兩個(gè)重要的特征:1、以miRNA及其靶向的眾多mRNA作為一個(gè)“模塊”去描述其對疾病發(fā)生、發(fā)展的影響,符合現(xiàn)代科學(xué)研究的“整體觀”,具有較高的科學(xué)性;2、從網(wǎng)絡(luò)的全局,我們更容易看到各miRNA調(diào)控的mRNA數(shù)量和功能,因此也更直觀和容易篩選出起關(guān)鍵作用的miRNA,從而為疾病防治靶點(diǎn)的研究提供關(guān)鍵線索。為此,我們率先在國際上開展輻射致癌“miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)”研究,并基于該網(wǎng)絡(luò)篩選出了miR-486作為輻射致癌中的關(guān)鍵miRNA做進(jìn)一步的生物學(xué)研究。從動(dòng)物、細(xì)胞水平驗(yàn)證miR-486對腫瘤細(xì)胞的作用及對輻射致癌的影響,并確認(rèn)了其靶向的mRNA和結(jié)合位點(diǎn),在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究其下游的分子通路,為輻射致癌新靶點(diǎn)的研究提供了新思路。主要研究內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、獲取輻射致癌相關(guān)的miRNA表達(dá)譜和基因表達(dá)譜利用多次小劑量γ射線照射建立輻射誘導(dǎo)胸腺淋巴瘤模型,提取三樣本重復(fù)的輻射誘導(dǎo)胸腺淋巴瘤組織及正常對照組織來源的總RNA,通過Affymetrix miRNA Array和mRNA Array方法,發(fā)現(xiàn)輻射致癌組織與正常組織miRNA總體表達(dá)譜有顯著的差異,篩選出63條差異表達(dá)miRNA。結(jié)合miRNA芯片和Real Time-PCR驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與正常胸腺組織相比較,輻射誘導(dǎo)小鼠T淋巴瘤組織中明確上調(diào)的miRNA有15條,分別是miR-762,miR-714,miR-467a,miR-455,miR-699,miR-712,miR-685,miR-705,miR-494,miR-711,miR-181d,miR-149,miR-720,miR-744,miR-210等;而輻射致癌組織中下調(diào)最明確的miRNA有11條,分別是miR-145,miR-376b,miR-708,miR-152,miR-143,miR-200c,miR-193b,miR-203,miR-100,miR-99a,miR-486。發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的26條輻射致癌組織差異表達(dá)的miRNA,可為后續(xù)研究提供重要線索。2、構(gòu)建與輻射誘導(dǎo)的小鼠胸腺T淋巴瘤相關(guān)的差異信號通路圖和關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖通過GO富集分析、KEGG通路分析及生物信息學(xué)分析,共得到輻射誘導(dǎo)的小鼠胸腺T淋巴瘤相關(guān)的283個(gè)信號通路差異圖,找出了最具代表性的幾條通路,其中五個(gè)可能在輻射致癌中發(fā)揮重要功能的的信號通路圖,它們分別是:凋亡信號通路,細(xì)胞周期信通路,cytokine-cytokines receptor pathway,NF-κB信號通路和p53信號通路。經(jīng)過對TargetScan、miRanda、PicTar、miRBase 4種預(yù)測方法、4個(gè)軟件結(jié)果的匯總,最終得到1070個(gè)miRNA-mRNA潛在靶向關(guān)系;再通過對輻射致癌組織與正常胸腺組織mRNA表達(dá)譜分析,篩選到3160個(gè)差異基因,最后將兩個(gè)結(jié)果進(jìn)行匹配,共得到567個(gè)預(yù)測與芯片篩查結(jié)果一致的mRNA。進(jìn)一步,我們通過MAS分析,首次成功構(gòu)建了輻射誘導(dǎo)的小鼠胸腺T淋巴瘤相關(guān)的miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖,有助于從miRNAmRNA網(wǎng)絡(luò)層面揭示輻射誘導(dǎo)T淋巴瘤的分子機(jī)制,為輻射致癌的相關(guān)研究提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3、研究miRNA-486表達(dá)水平與小鼠T淋巴瘤之間的關(guān)系通過對小鼠胸腺T淋巴瘤相關(guān)miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖的分析,篩選和鎖定了一條處于miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖HUB地位且在輻射致癌中未見報(bào)道的miRNA即miR-486進(jìn)行深入研究。成功構(gòu)建miRNA-486上調(diào)和下調(diào)細(xì)胞模型以及具有知識產(chǎn)權(quán)的miR-486 KO小鼠,體外實(shí)驗(yàn)通過表達(dá)和下調(diào)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)體系,發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-486可以顯著抑制小鼠T淋巴瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力,促進(jìn)小鼠T淋巴瘤細(xì)胞凋亡。而下調(diào)miRNA-486則能明顯提高細(xì)胞增殖活力,抑制小鼠T淋巴瘤細(xì)胞的凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建過表達(dá)miR-486的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤發(fā)現(xiàn):過表達(dá)miR-486抑制腫瘤的生長。通過對miR-486敲除小鼠進(jìn)行多次小劑量γ射線照射誘導(dǎo)輻射致癌發(fā)現(xiàn):miR-486敲除小鼠的成瘤率明顯升高,促進(jìn)輻射致癌的發(fā)生。提示miR-486在輻射致癌中扮演重要角色。4、探索miR-486調(diào)控T淋巴瘤細(xì)胞的新靶點(diǎn)結(jié)合前期的基因表達(dá)譜結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)IGF2BP3在輻射誘導(dǎo)的小鼠胸腺T淋巴瘤中上調(diào)倍數(shù)最大,且與miR486靶點(diǎn)預(yù)測的結(jié)果相一致。因此,我們認(rèn)為IGF2BP3很可能是miR-486調(diào)控T淋巴瘤細(xì)胞的重要靶點(diǎn)。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn):當(dāng)與IGF2BP3的mRNA作用時(shí),野生型組miR-486和Ad-miR-486的熒光素酶活性顯著下降,miR-486 ASO的熒光素酶活性升高。突變型組熒光素酶活性卻無明顯變化。這說明miR-486主要通過3’UTR依賴的方式靶向作用于IGF2BP3。通過miRNA-mRNA相關(guān)性分析和螢光素酶實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)體系證實(shí)了miR-486調(diào)控T淋巴瘤細(xì)胞的一個(gè)新靶點(diǎn)即IGF2BP3,發(fā)現(xiàn)miR-486可有效抑制IGF2BP3蛋白和mRNA。利用功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IGF2BP3可以顯著促進(jìn)T淋巴瘤細(xì)胞惡性增殖并可以逆轉(zhuǎn)miR-486對T淋巴瘤細(xì)胞的調(diào)控作用,從另一個(gè)方面再次證明了IGF2BP3是miR-486調(diào)控T淋巴瘤細(xì)胞的一個(gè)新靶點(diǎn)。5、闡明miR-486靶向IGF2BP3的關(guān)系及作用機(jī)制機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)miR-486主要通過3’UTR依賴的方式靶向作用于IGF2BP3;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IGF2BP3的3-UTR區(qū)有兩個(gè)miR-486的結(jié)合位點(diǎn),即896-903位點(diǎn)及928-934位點(diǎn),兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都對IGF2BP3被miR-486調(diào)控起作用,且896-903位點(diǎn)結(jié)合貢獻(xiàn)可能略強(qiáng)于928-934位點(diǎn)與miR-486的結(jié)合。這些結(jié)果在輻射致癌早期監(jiān)測、早期干預(yù)和特異治療研究中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。6、探索miR-486靶向IGF2BP3調(diào)控輻射致癌的機(jī)制免疫組化的結(jié)果顯示過表達(dá)miR-486能夠抑制IGF2BP3與IGF2的表達(dá),而miR-486敲除促進(jìn)IGF2BP3和IGF2的表達(dá)。同時(shí)Western Blot結(jié)果提示過表達(dá)miR-486可能通過IGF2BP3/IGF2/PI3K/AKT/mTOR的信號通路來發(fā)揮作用,通過抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白D1,D3,CDK2,CDK4,CDK6,P21,P27等的表達(dá)來抑制增殖。下圖是我們根據(jù)研究結(jié)果提出的miR-486調(diào)控輻射誘導(dǎo)小鼠T淋巴瘤的作用機(jī)理圖。miR-486調(diào)控T淋巴瘤細(xì)胞功能可能主要通過一個(gè)重要下游新靶點(diǎn)IGF2BP3來實(shí)現(xiàn)的:即在miR-486正常表達(dá)水平情況下,可以有效抑制其靶點(diǎn)IGF2BP3,從而使IGF2BP3的表達(dá)水平維持在較低水平,有效抑制T淋巴瘤進(jìn)展。反之,當(dāng)miR-486表達(dá)水平下降時(shí),可削弱對其靶點(diǎn)IGF2BP3的有效抑制,IGF2BP3表達(dá)增加,IGF2BP3表達(dá)增加可以顯著促進(jìn)T淋巴瘤細(xì)胞的惡性增殖并抑制T淋巴瘤細(xì)胞的凋亡。電離輻射可導(dǎo)致miR-486表達(dá)水平異常,表現(xiàn)為miR-486表達(dá)水平顯著下降,由此導(dǎo)致因miR-486表達(dá)不足而不能有效地抑制其靶點(diǎn)IGF2BP3,使得IGF2BP3的表達(dá)水平顯著增高并持續(xù)維持在較高水平,進(jìn)而顯著促進(jìn)T淋巴瘤細(xì)胞的惡性增殖并抑制T淋巴瘤細(xì)胞的凋亡,最終表現(xiàn)為輻射誘導(dǎo)小鼠T淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。由此可見,miR-486的表達(dá)水平對小鼠T淋巴瘤的發(fā)生可能起到關(guān)鍵的作用。（？）討論分析目前關(guān)于miRNA在腫瘤中的作用及其機(jī)制研究主要集中在一般的臨床腫瘤,而在輻射致癌領(lǐng)域中的研究相對較少,在輻射致癌的分子機(jī)制問題上國內(nèi)外至今仍有大量空白點(diǎn),很多重要問題并不十分清楚。經(jīng)國內(nèi)外文獻(xiàn)調(diào)研分析,有關(guān)輻射致癌中miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)分析的分子網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建工作目前尚未見報(bào)道,不少miRNA(例如miR-486等)在輻射致癌中的作用目前也未見報(bào)道。本課題組從國防和國家核能發(fā)展對醫(yī)學(xué)防護(hù)的需求出發(fā),深入研究輻射致癌的分子機(jī)制,并在miRNA研究領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)數(shù)條與輻射致癌密切相關(guān)的miRNA。研究從理清眾多miRNA在輻射致癌中的相互之間關(guān)系,篩選關(guān)鍵的miRNA并尋找新的靶向分子,闡明它們的具體功能和機(jī)制入手,利用miRNA芯片和基因芯片等多項(xiàng)先進(jìn)的生物信息學(xué)研究技術(shù),大規(guī)模分析了腫瘤組織和正常組織的表達(dá)譜差異,確定差異表達(dá)分子,然后利用生物信息學(xué)手段標(biāo)注出這些差異表達(dá)的生物學(xué)意義,篩選出一批與輻射致癌相關(guān)的miRNA分子,獲得重要分子miR-486及其靶向位點(diǎn)IGF2BP3。通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析,可以發(fā)現(xiàn)輻射致癌組織中miRNA表達(dá)譜和基因表達(dá)譜會(huì)發(fā)生顯著改變。以本研究輻射誘導(dǎo)胸腺淋巴瘤模型為例,共篩選出63條差異表達(dá)miRNA,其中上調(diào)最顯著的有15條,下調(diào)最顯著的有11條。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的輻射誘導(dǎo)的小鼠胸腺T淋巴瘤相關(guān)的283個(gè)信號通路差異圖,顯示它們的重要程度以及在輻射致癌中可能發(fā)揮的作用意義。構(gòu)建的輻射誘導(dǎo)的小鼠胸腺T淋巴瘤miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖更是有助于從miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)層面分析它們之間的復(fù)雜關(guān)系,為尋找關(guān)鍵分子提供新的線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。幸運(yùn)的是,本研究通過對小鼠胸腺T淋巴瘤相關(guān)miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖的分析,篩選出一條處于miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖HUB地位且在輻射致癌中未見報(bào)道的miRNA(即miR-486),通過一系列深入研究,發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)水平與小鼠胸腺淋巴瘤細(xì)胞的增殖和凋亡等密切相關(guān),而且這種效應(yīng)主要通過3’UTR依賴的方式靶向作用于IGF2BP3實(shí)現(xiàn)的,強(qiáng)烈提示miR-486在輻射致癌中扮演重要角色。綜上所述,本課題從miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)層面和關(guān)鍵分子的篩選方面為揭示輻射誘導(dǎo)T淋巴瘤的分子機(jī)制提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù);獲得的新關(guān)鍵分子miR-486也可能在輻射致癌早期監(jiān)測、早期干預(yù)和特異治療研究中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。研究結(jié)果也可以為其它類型腫瘤的研究提供新思路、新靶點(diǎn)、新線索。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R818
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