【摘要】：第一部分COL1A2基因3’非翻譯區(qū)插入/缺失多態(tài)與心源性猝死風險的關(guān)聯(lián)研究目的:研究位于COL1A2基因3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region,3’UTR)的插入/缺失(Ins/Del,Indel)多態(tài)rs3917與中國人群心源性猝死(Sudden cardiac death,SCD)風險之間的關(guān)聯(lián),并運用基因型-表型關(guān)聯(lián)研究和生物信息學(xué)方法探討該多態(tài)在心源性猝死發(fā)生發(fā)展中可能產(chǎn)生的作用及潛在的分子機制。方法:(1)使用候選基因的方法篩選出一批位于COL1A2基因3’UTR的多態(tài)位點,并選取具有潛在功能的七堿基Indel多態(tài)位點rs3917作為研究對象。收集79例SCD和328例正常對照的血液樣本,分別提取樣本基因組DNA并進行PCR擴增及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行基因分型,使用Logistic回歸統(tǒng)計分析該多態(tài)與SCD風險之間的關(guān)聯(lián)。(2)采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測具有不同基因型的心肌組織中COL1A2 m RNA的表達量,并分析基因型與m RNA表達量之間的關(guān)系。(3)利用生物信息學(xué)方法預(yù)測可與COL1A2 3’UTR結(jié)合且受rs3917多態(tài)影響的Micro RNA(mi RNA)(4)構(gòu)建包含rs3917多態(tài)的約300個堿基對的重組質(zhì)粒p GL3-COL1A2-WT/MT并轉(zhuǎn)染293T細胞系,分為四組,p GL3-COL1A2-WT/MT實驗組和對照組,實驗組加入mi R-296-3p mimic,對照組加入mimic control,24小時后,運用雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)(Dual-luciferase assay system)檢測各轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性,驗證mi R-296-3p對COL1A2基因表達的影響。結(jié)果:(1)基因分型結(jié)果顯示,COL1A2基因3’UTR的rs3917位點具有較好的多態(tài)性,對照組中的等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05),說明納入的樣本具有群體代表性。校正性別、年齡風險因素后,運用Logistic回歸分析法對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示:攜帶Ins/Del基因型的個體較Ins/Ins的個體發(fā)生SCD的風險顯著增高(OR=1.97,95%CI:1.09-3.56,P0.05,Statistical power=0.647);分析等位基因發(fā)現(xiàn),攜帶Del等位基因的個體較攜帶Ins等位基因的個體發(fā)生SCD的風險顯著增高(OR=1.82,95%CI:1.08-3.06,P0.05)。(2)Real-time PCR結(jié)果顯示,Ins/Del基因型與心肌組織中COL1A2基因的低表達顯著相關(guān)。(3)Miranda軟件預(yù)測結(jié)果提示,hsa-mi R-296-3p可能影響COL1A2基因的表達。(4)雙熒光素酶分析結(jié)果顯示,與對照組相比,加入mi R-296-3p后抑制p GL3-COL1A2-WT/MT實驗組的報告基因表達,且WT實驗組中的抑制作用更明顯。結(jié)論:(1)在中國人群中,rs3917多態(tài)與SCD風險之間存在顯著關(guān)聯(lián)。(2)不同基因型的心肌組織與對應(yīng)的m RNA表達量之間存在顯著的基因型-表型關(guān)聯(lián)。(3)rs3917多態(tài)插入型序列可能通過干擾COL1A2 m RNA與hsa-mi R-296-3p的結(jié)合來影響基因的表達,進而參與SCD的發(fā)生。第二部分MIF基因啟動子區(qū)多態(tài)與心源性猝死風險的關(guān)聯(lián)研究目的:研究位于MIF基因啟動子區(qū)的-794CATT5-8微衛(wèi)星多態(tài)與中國人群心源性猝死(Sudden cardiac death,SCD)風險之間的關(guān)聯(lián),分析比較該多態(tài)在不同人群中的基因型和等位基因頻率分布及與不同疾病之間可能存在的關(guān)系。方法:(1)采用候選基因的方法篩選出一批位于MIF基因啟動子區(qū)的多態(tài)性位點,并從中選取具有潛在功能的-794 CATT5-8微衛(wèi)星多態(tài)位點作為研究對象。采用病例-對照研究方法,收集79例SCD和313名正常對照的血液樣本,分別提取樣本基因組DNA并進行PCR擴增及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對該多態(tài)位點進行基因分型,并使用Logistic回歸統(tǒng)計分析該多態(tài)與SCD風險之間的關(guān)聯(lián)。(2)運用統(tǒng)計學(xué)方法分析比較-794 CATT5-8多態(tài)在不同國家的等位基因頻率分布,分析該多態(tài)與不同疾病的關(guān)系。結(jié)果:(1)-794 CATT5-8多態(tài)與SCD風險無顯著關(guān)聯(lián)。(2)統(tǒng)計結(jié)果顯示,在中國人群中,-794 CATT5-8多態(tài)的等位基因頻率分布與日本相近(P=0.827),與美國及歐洲有顯著差異(P=0.005,P=0.0001)。結(jié)論:(1)在中國人群中,MIF基因啟動子區(qū)的-794 CATT5-8多態(tài)與SCD風險之間無顯著關(guān)聯(lián)。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：D919
【圖文】：

的平均年齡為 50 歲（中位年齡 49 歲）；性別方面，男女比例為 10.3∶1。在死亡動方面，根據(jù)調(diào)查記錄，11 例（13.9%）SCD 發(fā)生在睡眠中，24 例（30.4%）發(fā)爭吵或其他強烈的情感活動中，有 42 例（53.2％）是在飲酒或受輕微損傷后發(fā)定義為非特異性）。3917 位點基因分型及測序結(jié)果不同基因型樣本擴增出的片段長度不同，可通過 7%非變性聚丙烯酰胺凝膠連續(xù)系統(tǒng)垂直電泳進行區(qū)分，銀染顯色結(jié)果為：缺失型純合子一條帶，片段長度為p；插入型純合子一條帶，片段長度為 174bp；插入/缺失雜合子為兩條帶，長度為 167bp 和 174bp（圖 1）。采用桑格測序法對分型結(jié)果進行驗證（圖 2）。分型顯示，在 SCD 病例-對照組中 Ins/Ins，Del/Del 和 Ins/Del 三種基因型均可被檢測

圖 2. COL1A2（rs3917）位點桑格測序圖Fig 2. Sequencing analysis of COL1A2（rs3917）：下劃線顯示的為 rs3917 多態(tài)插入的七個堿基序列dy-Weinberg 遺傳平衡檢驗 rs3917 位點在對照組中的基因型分布進行 Hardy-Weinberg 遺傳平衡吻合度檢結(jié)果符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡規(guī)律（表 3），說明納入的樣本具有群體代表 3. rs3917 位點的 Hardy-Weinberg 平衡吻合度檢驗結(jié)果able 3. Hardy-weinberg equilibrium testing of rs3917 within the control group基因型 Del/Del Ins/Del Ins/In觀察值 2 60 266期望值 3 57 267(O-E) 2/E 0.333 0.158 0.004

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本文編號：2728601