【摘要】：背景和目的人類Y染色體的很大一部分,即非重組Y染色體部分(Non-recombinant Y chromosome NRY),遵從嚴(yán)格的父系遺傳。由于在減數(shù)分裂過程中Y染色體該部分沒有重新組合,因此可以確定所有人類NRY變體的等級血統(tǒng)順序并推斷它們在系統(tǒng)發(fā)育樹中血統(tǒng)的順序和時間。然而在父子遺傳信息一代代的傳遞過程中,Y染色體也在漸漸地積累著一些變化——遺傳突變。正是因為遺傳突變積累的存在,使得人類父系遺傳的體系中,相距越遠的兩個個體Y染色體差異越大;正是這些遺傳突變的積累,形成了Y染色體遺傳標(biāo)記。Y染色體上的遺傳標(biāo)記有很多,主要有微衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA、衛(wèi)星DNA、插入與缺失、單核苷酸多態(tài)性五類。目前在法醫(yī)學(xué)研究中以及實際檢案中最常用到的是微衛(wèi)星DNA和單核苷酸多態(tài)性,即Y-STR和Y-SNP。并且,隨著下一代測序(Next generation sequencing NGS)的快速發(fā)展,以及測序成本的降低,未來幾年將有大量人類基因組數(shù)據(jù)可供使用。這些數(shù)據(jù)可用于優(yōu)化和提高Y染色體系統(tǒng)發(fā)育樹的分辨率。但是NGS產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量急劇增加,并且產(chǎn)生的數(shù)據(jù)格式較為復(fù)雜,對法醫(yī)學(xué)實踐中需要提取某一位點信息的需求形成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。為了有效地分析和闡釋Y染色體NGS數(shù)據(jù),本實驗通過對STRait Razor v3、AMY-tree及Y-leaf三個軟件來解析全基因組DNA二代測序結(jié)果數(shù)據(jù),以比較各軟件的效力,能夠為從二代測序結(jié)果中Y-STR信息和提取高分辨率Y-SNP單倍群提供方法參考,并能為法醫(yī)物證工作中應(yīng)用二代測序技術(shù)獲取Y-DNA遺傳標(biāo)記提供幫助。方法1.采用上海萊楓公司2ml血液基因組DNA提取試劑盒提取一名河南漢族男性外周血基因組DNA。2.以二代測序儀BGISEQ-500對該例樣品進行全基因組DNA重測序。3.提取二代測序結(jié)果中的Y-STR信息:使用STRait Razor v3軟件包。在Windows操作系統(tǒng)上,從https://github.com/Ahhgust/STRaitRazor頁面下載并安裝STRait Razor v3軟件包。把二代測序結(jié)果.fastq文件通過該軟件解讀出.fastq文件中所包含的Y染色體STR等信息。4.提取二代測序結(jié)果中的特異性Y-SNP信息:使用AMY-tree軟件;并以之判斷該樣品在Y單倍群進化樹(International Society of Genetic Genealogy,ISOGG,http://www.isogg.org/tree)中的分支歸屬。從bio.kuleuven.be/eeb/lbeg下載并安裝AMY-tree軟件在Windows操作系統(tǒng)上。將全基因組DNA重測序結(jié)果中的Y染色體突變列表按照AMY-tree軟件要求格式修改成輸入文件,對軟件所需其他支持文件下載并輸入,運行程序,得出樣本所屬ISOGG單倍群分支以及最新潛在Y-SNP等信息。5.提取測序結(jié)果中的特異性Y-SNP信息:使用Y-leaf軟件;并以之判斷該樣品在Y單倍群進化樹(International Society of Genetic Genealogy,ISOGG)中的分支歸屬。在https://www6.erasmusmc.nl/genetic_identification/resources/Yleaf/下載Y-leaf軟件,在Linux操作系統(tǒng)上,根據(jù)y-leaf軟件的README文件進行安裝。提前安裝好Python、wget、Libcurl、readline、R、samtools等基礎(chǔ)支持軟件包。然后在鄭州大學(xué)超算中心上運行y_leaf來分析二代測序結(jié)果bam或fastq文件,解讀其中的Y-SNPs及其單倍群。6.以Yfiler試劑盒對該樣品進行檢測;對該樣品進行M117分型,以驗證提取的遺傳標(biāo)記信息。7.以STRAIT Razor v3識別出的Y-STR個數(shù),與Yfiler試劑盒檢測出的Y-STR個數(shù)相比,求出全基因組測序50×背景下的Y-STR檢出率;以AMY-tree識別出Y單倍群進化樹SNP個數(shù)除以輸入該軟件的Y-SNPs總數(shù),求其Y-SNP識別率;以Yleaf識別出Y單倍群進化樹SNP個數(shù)除以輸入該軟件的Y-SNPs總數(shù),求其Y-SNP識別率。并以卡方檢驗比較AMY-tree與Yleaf從全基因組數(shù)據(jù)中提取Y-DNA遺傳標(biāo)記信息的效力。結(jié)果1.全基因組重測序得到3429964個SNP,其中98.77%出現(xiàn)在dbSNP數(shù)據(jù)庫里,其中96.98%在千人基因組計劃(the 1000 Genomes Project)的數(shù)據(jù)庫中。在全基因組中新發(fā)現(xiàn)的SNP共32050個。Y染色體上得到2825個SNP。2.STRait Razor v3軟件包的Powerseq.config組件分析的STR位點和性別信息結(jié)果顯示,獲得48742條性別信息(Amelogenin基因)和236條STRs分型結(jié)果,其中Y-STR信息49條(常染STR187條)。軟件讀出的6個Y-STR及其判型結(jié)果與Yfiler試劑盒檢測結(jié)果基本一致。3.AMY-tree解析結(jié)果為單倍群為O2a2c2c*[O-Page23*],比起該樣品的電泳檢測結(jié)果(M117衍生型,指示該樣品屬于單倍群進化樹分支O2a2b1a1)不完全一致。這是因為AMY-tree的數(shù)據(jù)庫還是2014年數(shù)據(jù),沒能及時更新的原因。4.Yleaf輸出結(jié)果為在Y染色體上共比對出41392個Y-SNPs,共有908個Y-SNPs是衍生型,指示出該樣品屬于O2a2b1a1a1a1a分支,比起該樣品的電泳檢測結(jié)果(M117衍生型,指示該樣品屬于單倍群進化樹分支O2a2b1a1)更為具體。5.在全基因組測序50×所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)中,用STRAIT Razor v3、AMY-tree及Y-leaf提取相關(guān)Y-DNA遺傳標(biāo)記信息時的檢出率/識別率分別為35%、73%及99%。AMY-tree及Yleaf對Y-SNPs的識別效力有顯著性差異,以Yleaf更為準(zhǔn)確。結(jié)論1.STRait Razor v3軟件包直接從全基因組測序結(jié)果中提取出相關(guān)Y-STR甚至常染色體STR信息。且其工作平臺可為Windows操作系統(tǒng),安裝簡便,運行可靠,可供目前的法醫(yī)DNA實驗室常規(guī)使用。2.Y-leaf是一種適用于從所有類型的Y染色體NGS數(shù)據(jù)進行準(zhǔn)確、高分辨率的單倍群推斷的軟件。3.基于下一代測序的STR分型在現(xiàn)有數(shù)據(jù)輸出方式基礎(chǔ)上,對STR基因座進行全解析度分型,進一步關(guān)注STR內(nèi)部的序列多態(tài)性,顯著提升STR基因座的個體識別能力�；贜GS技術(shù)進行STR分型的技術(shù)路線是可行的。4.比較各軟件的效力,能夠為從二代測序結(jié)果中提取Y-STR信息和提高Y-SNP單倍群分辨率提供方法參考,為法醫(yī)物證工作中應(yīng)用二代測序技術(shù)獲取Y-DNA遺傳標(biāo)記提供幫助。5.常規(guī)全基因組測序結(jié)果難以足額提供法醫(yī)DNA遺傳標(biāo)記,出于法醫(yī)應(yīng)用目的的二代測序技術(shù)應(yīng)該有別于常規(guī)的全基因組測序或全外顯子測序等技術(shù)。
【圖文】：

二代測序片段拼接示意圖（引自NovelBioinformatics）

從法醫(yī)學(xué)實戰(zhàn)的角度來看，不僅是巨大的數(shù)據(jù)量，而且復(fù)雜的數(shù)據(jù)格式也對其廣泛應(yīng)用形成了天然壁壘。二代測序產(chǎn)生的文件，主要有.fastq 和.bam 兩種格式。.fastq 格式的文件格式內(nèi)容見圖 2.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：D919

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