【摘要】：目的死亡時間(postmortem interval,PMI)的精確推斷一直是法醫(yī)學中的重點和難點,但是到目前為止還沒有得到統(tǒng)一的檢測方法和指標。本研究通過構建骨骼肌中環(huán)狀RNA(circular RNA,circ RNA)表達譜,篩選出人體骨骼肌中與死亡時間具有時序性變化的circ RNAs,并進一步對篩選出的circ RNAs進行驗證,然后探討其相對表達量與死亡時間的相關性,為法醫(yī)學中對死亡時間推斷提供一個新的思路及指標。方法(1)芯片實驗:(1)選取2例外界溫度、濕度相對一致,已知死亡時間在24 h以內的個體,取其右側第三、四肋間肌組織,放置在PBS緩沖液中于溫度為18℃,濕度為50%的人工氣候箱中模擬自然降解過程;(2)分別于尸檢即刻(0天)、3天、5天、7天、10天各取50 g組織放入液氮中凍存,然后進行總RNA的提取;(3)對提取的RNA進行質檢,質檢合格后,進行逆轉錄、探針標記、基因芯片檢測等實驗,最終得到circ RNA表達譜。(2)circ RNAs的篩選及驗證:(1)將后續(xù)收集到的與之前外界溫度、濕度相對一致的18例死亡個體的肋間肌檢材放置在相同條件的人工氣候箱中;(2)分別于死亡1-10天定時取適量組織進行RNA提取、逆轉錄,然后將所得c DNA放置在-80℃冰箱,以便后續(xù)實驗的進行;(3)根據(jù)Norm Finder軟件篩選GAPDH、β-Actin、mir133a-3p三者中最穩(wěn)定的內參基因;(4)根據(jù)所得的circ RNA表達譜篩選與死亡0天具有顯著差異的circ RNA,并去除分子量過大或過小以及表達量較低的circ RNAs;(5)對篩選出的circ RNAs在文獻中查找其已經(jīng)驗證過的引物序列,如有相同circ RNA,則直接利用其序列;若未找到相關文獻報道,則利用circbase查找其基因序列,并用primer-blast進行引物設計;(6)用上述所得c DNA對所篩選出的circ RNAs進行Q-PCR實驗,在18例檢材中驗證它們的相對表達量與死亡時間的相關性。(3)統(tǒng)計分析:利用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結果骨骼肌組織中共檢測出13156個circRNAs,通過與死亡0天的circRNAs的相對表達量相比,具有明顯下降趨勢的circ RNAs在第三天共有353個,第5天共有259個,第7天共有273個,第10天共有290個,且均為P0.05,Fold change2。但在10天內整體呈下降趨勢的circ RNAs只有hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0001946、hsa_circ_0001971等7個。根據(jù)Norm Finder軟件對內參基因的篩選,發(fā)現(xiàn)mir133a-3p在本實驗中最穩(wěn)定。對所篩選出的7個circ RNAs在18例檢材中進行驗證,發(fā)現(xiàn)只有hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0001871等5個circ RNAs隨著死亡時間的增加,其相對表達量顯著下降,且具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而hsa_circ_0001946、hsa_circ_0001971等2個circ RNAs的表達為陰性。結論(1)肌肉組織可作為測定中晚期死亡時間的候選組織(2)mir133a-3p在本實驗中為最穩(wěn)定的內參基因。(3)經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0001871等5個基因隨著死亡時間增加,其相對表達量顯著降低。(4)circ RNA可作為一種較為穩(wěn)定的生物標記物用于死亡時間推斷的研究。
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：D919

【參考文獻】

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1 呂葉輝;張恒;潘暉;馬開軍;李文燦;陳文峰;江潔清;薛愛民;張萍;王慧君;陳龍;;不同死因大鼠心肌內多種RNA相對表達量變化與PMI的關系[J];法醫(yī)學雜志;2014年01期

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1 江萌;非瓣膜病房顫患者血漿miR-1、miR-133a的表達水平及臨床意義[D];南華大學;2015年

2 約爾古麗·玉素甫阿吉（YUSUFUAJI·Yue-erguli）;microRNA-1,133在心房顫動模型犬與患者心房肌中的表達差異[D];新疆醫(yī)科大學;2015年

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本文編號：2683433