【摘要】：背景和目的:放射性肺損傷(Radiation-induced lung injury,RILI)是核事故幸存者的主要并發(fā)癥,長期困擾著生存病人的生活質(zhì)量。RILI也是胸部腫瘤放療劑量的主要限制因素,影響腫瘤的控制效果。RILI的發(fā)生機制非常復雜,涉及到一系列細胞及分子的相互作用,病理上主要表現(xiàn)為炎癥細胞的遷移與浸潤、成纖維細胞的增生與分化、膠原蛋白的分泌與積聚、血管壁的增厚與閉塞、正常肺泡結(jié)構(gòu)的破壞與重塑等。近年研究發(fā)現(xiàn),在放射損傷后數(shù)個小時內(nèi)發(fā)生的血管內(nèi)皮細胞凋亡可能是導致上述病理表現(xiàn)的啟動機制,阻斷血管內(nèi)皮細胞的凋亡可以緩解放射損傷的程度。成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)廣泛參與胚胎發(fā)育、組織再生、血管生成等多種生物學過程,也在皮膚、骨、尿道、子宮、神經(jīng)等組織器官的缺損或損傷模型中發(fā)揮促修復作用。研究發(fā)現(xiàn),bFGF也在放射損傷中發(fā)揮保護作用,主要機制為抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡。此外,微血管內(nèi)皮細胞對輻照的敏感性明顯高于大血管,可能與bFGF在微血管基底膜上的分布較少甚至缺乏有關(guān)。肺具有異常豐富的微血管系統(tǒng),缺乏足夠的bFGF提供保護可能是肺對射線較為敏感的原因之一,因此外源性給予bFGF可能是緩解與修復RILI的有效方法。但是,bFGF在應(yīng)用中常面臨著靶向性低、透膜能力差、半衰期短等問題,為了達到有效的治療效應(yīng),需要提高bFGF的使用劑量,但是高劑量給藥可能會對其他正常組織造成潛在危險。靶向給藥是近年來的研究熱點,可以提高病灶中的藥物濃度,降低正常組織中的藥物分布,從而在增強治療效應(yīng)的同時降低副作用。其中,靶向性多肽是一種具有良好應(yīng)用前景的遞送配體,具有滲透性好、合成方便、免疫原性低、成本低、易修飾等優(yōu)點。CGSPGWVRC是通過噬菌體展示技術(shù)獲得的肺血管內(nèi)皮細胞靶向肽(Lung endothelial cell-targeted peptide,LET),并經(jīng)體外和體內(nèi)實驗證實了其較好的肺內(nèi)皮細胞靶向能力。綜上所述,我們準備用LET對bFGF進行修飾(LET-bFGF),以提高bFGF重組蛋白對肺內(nèi)皮細胞的靶向能力,從而增強bFGF對RILI的修復功能。方法:1.LET-bFGF的制備:在pET28a-bFGF質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,將一段Linker序列(共15個氨基酸,即45個核苷酸)和LET序列(共9個氨基酸,即27個核苷酸)連接至bFGF的羧基端,通過PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等方法構(gòu)建pET28a-LET-bFGF質(zhì)粒,然后通過大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得LET-bFGF重組蛋白,使用鎳柱親和層析法進行純化,最后采用MTT試驗檢測生物學活性。2.LET-bFGF的肺靶向驗證:27只SD大鼠隨機分為3組:對照組、bFGF組、LET-bFGF組。bFGF組和LET-bFGF組分別尾靜脈注射bFGF和LET-bFGF(25 nmol/kg),對照組使用生理鹽水作為對照。在注射后10 min、1 h和6 h時,Elisa檢測肺組織和血清中bFGF的含量。24只SD大鼠隨機分為4組:正常+bFGF組、放射+bFGF組、正常+LET-bFGF組、放射+LET-bFGF組。正常組使用正常大鼠,放射組使用RILI大鼠,bFGF組和LET-bFGF組在造模后分別尾靜脈注射偶聯(lián)了Cy7的bFGF(bFGF-Cy7)和偶聯(lián)了Cy7的LET-bFGF(LET-bFGF-Cy7)(500μL,30μmol/L)。在注射后1 h時,小動物活體成像檢測在體和離體器官的熒光強度。24只SD大鼠隨機分為4組:正常+bFGF組、放射+bFGF組、正常+LET-bFGF組、放射+LET-bFGF組。正常組使用正常大鼠,放射組使用RILI大鼠,bFGF組和LET-bFGF組在造模后分別尾靜脈注射bFGF和LET-bFGF(100 nmol/kg)。在注射后1h時,免疫熒光染色檢測外源性bFGF在肺組織中的分布。3.LET-bFGF對RILI大鼠模型的修復作用:60只SD大鼠隨機分為4組:對照組、放射組、放射+bFGF組、放射+LET-bFGF組。對照組使用正常大鼠,其余三組使用RILI大鼠,放射+bFGF組和放射+LET-bFGF組在造模后分別尾靜脈注射bFGF和LET-bFGF(25 nmol/kg),對照組和放射組使用生理鹽水作為對照。在造模后早期(4 h),取肺組織進行TUNEL與CD31的雙重染色,以檢測LET-bFGF對肺血管內(nèi)皮細胞凋亡的保護作用;在造模后遠期(2個月),對大鼠進行肺部CT掃描,取肺組織進行HE染色、Masson染色和CD45的免疫組織化學染色,以檢測LET-bFGF對肺炎和肺纖維化的治療效應(yīng)。結(jié)果:1.在pET28a-bFGF質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,成功將一段45個核苷酸的Linker和27個核苷酸的LET序列連接于bFGF序列的羧基端,最終獲得pET28a-LET-bFGF質(zhì)粒,測序驗證序列完全正確。2.通過大腸桿菌表達系統(tǒng)和鎳柱親和層析法獲得純化蛋白,經(jīng)SDS-PAGE證實bFGF和LET-bFGF均符合理論分子量,分別為19.42 kD和21.50 kD,WB證實bFGF和LET-bFGF均可以與抗bFGF抗體特異性結(jié)合。3.bFGF與LET-bFGF均具有較好的生物學活性,而且LET靶向肽與Linker在bFGF羧基端的融合表達并未影響bFGF的生物學活性。4.LET-bFGF經(jīng)尾靜脈注射至大鼠體內(nèi)后,可迅速表現(xiàn)出明顯的肺靶向聚集效應(yīng),但是其體內(nèi)代謝也較快,注射后6 h便恢復至肺組織本底水平,可能主要通過腎臟排泄。5.放射損傷對LET-bFGF具有一定的趨化作用,可以增強LET-bFGF的肺靶向能力。6.在輻照后4 h時,凋亡主要發(fā)生于肺血管內(nèi)皮細胞,在輻照后2個月時,凋亡可廣泛發(fā)生于各種類型的細胞中,包括血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞、間質(zhì)細胞等,LET-bFGF可以抑制放射誘導的早期和遠期肺血管內(nèi)皮凋亡,其凋亡抑制效應(yīng)優(yōu)于bFGF。7.在輻照后2個月時,正常的肺泡結(jié)構(gòu)被嚴重破壞,肺泡間隔明顯增厚,大量的炎癥細胞浸潤,血管壁顯著增厚,部分肺毛細血管可發(fā)生擴張和淤血,LET-bFGF可以降低肺血管壁的增生,緩解其他肺組織結(jié)構(gòu)的紊亂,其保護效應(yīng)優(yōu)于bFGF。8.在輻照后2個月時,炎癥細胞大量分布于肺間質(zhì)與肺泡中,LET-bFGF可以降低放射誘導的肺部炎癥,而bFGF則未觀察到這種炎癥抑制效應(yīng)。9.在輻照后2個月時,肺部呈明顯的纖維化,影像學表現(xiàn)為大量廣泛分布的高密度影,肺平均密度顯著升高,LET-bFGF可以減輕放射誘導的肺纖維化程度,而bFGF則未觀察到這種纖維化抑制效應(yīng)。結(jié)論:肺內(nèi)皮細胞靶向肽LET修飾的bFGF具有較好的肺靶向能力,能夠在RILI中發(fā)揮良好的修復作用。
【圖文】：
圖 2-1 LET-bFGF 重組蛋白的構(gòu)建模式圖我們首先對實驗室保存的 pET28a-bFGF 質(zhì)粒進行了測序，從起始密碼子 ATG 至終止密碼子 TGA 共 528 個核苷酸，序列完全正確，見圖 2-2。根據(jù) linker 序列和肺靶向肽序列設(shè)計了 1 個上游序列和 2 個下游序列，共進行 2 次 PCR 擴增，然后通過雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等步驟，獲得了含 pET28a-LET-bFGF 質(zhì)粒的菌株，對其測序發(fā)現(xiàn)從起始密碼子 ATG 至終止密碼子 TGA 共 600 個核苷酸，序列完全正確，見圖 2-3。
圖 2-1 LET-bFGF 重組蛋白的構(gòu)建模式圖我們首先對實驗室保存的 pET28a-bFGF 質(zhì)粒進行了測序，從起始密碼子 ATG 至終止密碼子 TGA 共 528 個核苷酸，序列完全正確，見圖 2-2。根據(jù) linker 序列和肺靶向肽序列設(shè)計了 1 個上游序列和 2 個下游序列，共進行 2 次 PCR 擴增，然后通過雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等步驟，獲得了含 pET28a-LET-bFGF 質(zhì)粒的菌株，對其測序發(fā)現(xiàn)從起始密碼子 ATG 至終止密碼子 TGA 共 600 個核苷酸，，序列完全正確，見圖 2-3。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R818.7
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