【摘要】：研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH),又稱脫氧麻黃堿,屬于苯丙胺類興奮劑(Amphetamine-Typed Stimulant,ATS),其鹽酸鹽為無色透明晶體,外形狀如冰,俗稱“冰毒”,日本化學家A.Ogata于1919年首次合成。METH作用涉及廣泛,具有興奮中樞神經、擬交感、成癮等多種藥理毒理學特性,長期吸食者可嚴重影響其神經系統(tǒng)功能。而吸毒所繼發(fā)的各種暴力行為、死亡、復吸及戒斷性猝死不僅是社會性的問題也和法醫(yī)工作密切相關。近年來METH在國內大中城市的濫用情況仍然十分嚴峻,是繼海洛因之后,危害最為嚴重和廣泛的毒品,同時以甲基苯丙胺為主的新型合成毒品種類也逐漸增加濫用人員也呈現(xiàn)迅速的增長趨勢。METH可導致多巴胺能神經元的丟失及神經膠質細胞的反應性增生,進而可能引起多種退行性疾病相關的病理學改變,而細胞骨架的異�？赡芘c包括AD和PD在內的多種神經退行性疾病的發(fā)生及發(fā)展具有很大的關系。而近年來有文獻報道GSK3β底物的陣列表明GSK3β是調節(jié)微管動力學的關鍵激酶,提示GSK3β激酶可能通過對細胞骨架蛋白的調節(jié)參與METH的神經毒性損傷過程。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其功能多樣化,在腦組織中普遍表達并具有廣泛的底物。文獻報道α-Syn能與細胞骨架蛋白tau形成聚合體,被tau特異性激酶糖原合成酶激酶3β(GSK3β)磷酸化后,共同參與包括阿爾茨海默病在內的多種神經退行性疾病。表明GSK3β可能作為細胞骨架相關蛋白的上游調節(jié)分子蛋白與帕金森病等神經退行性疾病的發(fā)病密切相關。亦有報道顯示METH作用后可導致大鼠大腦副核(NAc)核心區(qū)GSK3β活性升高伴有行為學的明顯改變。本教研室在關于METH神經毒性的前期研究中的實驗結果顯示,METH可導致細胞骨架破壞,METH可以通過激活GSK3β引起α-突觸核蛋白(α-synuclein,細胞骨架相關蛋白)的表達升高及磷酸化水平升高,提示GSK3β在METH所致的細胞骨架損傷中都扮演了重要角色,并且是關鍵的一個靶點。亦有報道顯示METH作用后可導致大鼠大腦副核(NAc)核心區(qū)GSK3β活性升高伴有行為學的明顯改變。細胞骨架是主要由微管、微絲及中間絲三個部分所組成的蛋白纖維網狀結構體系,對于維持細胞正常的形態(tài)結構及功能行使均起著重要作用。本教研室前期的實驗數(shù)據(jù)表明,METH中毒大鼠中紋狀體區(qū)神經元GSK3β特異性磷酸化產物細胞骨架蛋白stathmin(op18)表達明顯升高,提示METH可能通過介導GSK3β活性的變化,影響除了 tau蛋白以外的其他相關細胞骨架蛋白。而細胞骨架相關蛋白改變和損傷是神經退行性變的病理基礎,提示METH所致神經元損傷乃至退行性變可能均與METH誘導的GSK3β的活性變化有關,但目前國內外的研究結果并未闡明相應的機制,需要進一步的研究和證實。本研究擬建立METH中毒細胞模型,通過形態(tài)學、免疫熒光、GSK3β及相關細胞骨架蛋白等指標的檢測,驗證METH作用引起GSK3β的活性變化。再通過GSK3β抑制劑(LiCL)進一步驗證GSK3β的活性變化對相關細胞骨架蛋白的影響,以期對GSK3β的活性變化而影響細胞骨架改變的可能調控機制和作用進行探討,進一步闡明METH神經毒性作用機制,為尋找METH神經毒性損傷戒毒藥物靶點提供理論基礎。目的:建立METH的中毒細胞模型,通過免疫熒光、GSK3β及相關細胞骨架相關蛋白等指標的檢測,從而研究METH對GSK3β活性的影響,以及GSK3β對后續(xù)相關細胞骨架相關蛋白所起的作用。再通過GSK3β抑制劑(LiCL)反證之前所得的結果,以進一步明確在METH影響下GSK3β活性變化介導的細胞骨架蛋白變化引起的細胞骨架重構,從而深入探究METH神經毒性作用機制,為尋找METH神經毒性損傷戒毒藥物新的靶點提供理論基礎。因此,我們擬研究GSK3β的活性變化對METH所致細胞骨架改變的可能調控機制和作用的進行探討,進一步闡明METH神經毒性作用機制。方法:1.在分化的PC12細胞及神經元原代細胞中建立METH中毒模型(1)先用10%新生胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基于6孔板內接種PC12細胞,并在37℃和5%CO2的敷箱內培養(yǎng),待細胞生長至密度達70%時,分別用含 Ommol/L、0.5mmol/L、0.1mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L 濃度 METH 的2%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時,然后提取細胞總蛋白,用Western Blot法檢測細胞磷酸化GSK3β(P-GSK3β)的表達變化情況,以此綜合并選取合適濃度建立細胞中毒模型。(2)將新生SD大鼠皮層神經元細胞用無胎牛血清(FBS)的專用神經元培養(yǎng)基接種6孔板中,細胞密度以70%為宜,在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng),待培養(yǎng)5-7天神經元形態(tài)趨近成熟時,分別用含Ommol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.Ommol/LMETH的無血清神經元專用培養(yǎng)基于恒溫敷箱內培養(yǎng)24小時后提取細胞總蛋白,再用Western Blot法檢測磷酸化GSK3β(P-GSK3β)的表達變化情況,以此綜合并選取合適濃度建立細胞中毒模型。2.探究GSK3β在METH誘導細胞骨架重構中的作用機制分別將PC12細胞和新生SD大鼠皮層神經元細胞分別接種于6孔板中,在37℃和5%C02條件下培養(yǎng)。待PC12細胞長至70%匯合時,用含Ommol/L、0.5mmol/L、0.1mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/LMETH 的 2%血清培養(yǎng)基于恒溫敷箱內繼續(xù)培養(yǎng)24小時,后提取細胞內總蛋白;待神經元原代細胞培養(yǎng)5-7天形態(tài)趨近成熟神經元時,用含 0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L METH的無血清神經元專用培養(yǎng)基于恒溫敷箱內培養(yǎng)24小時后提取細胞總蛋白,再用Western Blot法分別檢測細胞內細胞骨架相關蛋白水平的變化情況。接種PC12細胞及神經元原代細胞分別至6孔板培養(yǎng)皿中并將細胞分為4組:空白對照組(CON)、對照+抑制劑組(LiCL)、給藥組(METH)、給藥+抑制劑組(METH+LiCL),其中在對照+抑制劑組(LiCL)及給藥+抑制劑組(METH+LiCL)內提前加入抑制劑(LiCL)處理30分鐘后,再加入合適濃度的METH進行給藥處理,分別培養(yǎng)24小時后,收集細胞或細胞液進行以下各項實驗:(1)于倒置顯微鏡下觀察各組PC12細胞的形態(tài)學異常改變。(2)用Western Blot法分別對細胞骨架相關蛋白包括APC、磷酸化的TAU(P-TAU)、磷酸化的 CRMP2(P-CRMP2)、磷酸化的 STATHMIN(P-OP18)表達進行檢測。(3)采用共聚焦顯微鏡觀察細胞內微絲以及微管的變化。結果:1.PC12細胞及神經元原代細胞中METH中毒模型的建立經METH處理后的PC12細胞以及神經元原代細胞相較空白對照組GSK3β的磷酸化水平隨METH濃度增加逐漸增高。其中,在PC12細胞內,當METH濃度大于1.0mmol/L時,磷酸化GSK3β(P-GSK3β)升高與對照組相比均有顯著性差異(p0.05);而在神經元原代細胞內,當METH濃度大于0.4mmol/L時,P-GSK3β升高與對照組相比均有顯著性差異(p0.05)。當加入2.0 mmol/LGSK3β抑制劑LiCL時,可顯著抑制METH引起的PC12細胞以及神經元原代細胞內GSK3β活性表達升高.2.探究GSK3β在METH誘導細胞骨架重構中的作用機制(1)Western Blot檢測結果顯示,相比于空白對照組,經METH處理的PC12細胞以及神經元原代細胞內細胞骨架相關蛋白包括Tau、CRMP2、OP18的磷酸化水平及APC的表達均隨METH濃度增加而逐漸增高。(2)4組細胞模型分別經過不同的處理24h后,倒置顯微鏡下觀察PC12細胞的形態(tài)變化,可見METH組與CON組的細胞形態(tài)相比有了明顯改變,可見胞體大體變圓,突起變短甚至消失,部分細胞脫壁漂浮;CON+LiCL組細胞形態(tài)與CON組相比無明顯變化;而METH+LiCL組相較于METH組,無論是胞體還是突起損傷均有了明顯的改善。(3)Western Blot法檢測PC12細胞以及神經元原代細胞內各組細胞骨架相關蛋白表達發(fā)現(xiàn):CON+LiCL組細胞內APC總蛋白及TAU、CRMP2、OP18的磷酸化蛋白表達水平相比于CON組并無明顯變化,METH組細胞內APC總蛋白及TAU、CRMP2、OP18的磷酸化蛋白表達水平相比于CON組顯著升高(p0.05),而METH+LiCL組細胞內APC總蛋白及TAU、CRMP2、OP18的磷酸化蛋白表達水平相比于METH組顯著降低(p0.05)。(4)在共聚焦顯微鏡下觀察可見:在PC12細胞內,METH組細胞內微絲及微管較CON組排列上有一定程度上的紊亂。而在神經元原代細胞內,METH組除了胞內微絲及微管較CON組排列上的異常變化外還可發(fā)現(xiàn)軸突的縮短及細胞邊緣毛刺狀的改變。結論:1.磷酸化的GSK3β在METH處理的PC12細胞株以及神經元原代細胞內表達顯著上調,且上調趨勢隨METH濃度的增高而升高。GSK3β抑制劑LiCL可有效抑制GSK3β磷酸化水平的升高。2.METH可誘導細胞內GSK3β的磷酸化而引起GSK3β活性水平的升高,活化的GSK3β可以使下游的細胞骨架相關蛋白包括APC、TAU、CRMP2、OP18水平升高或發(fā)生磷酸化導致細胞骨架的紊亂進而重構,引起神經元退行性變。GSK3β抑制劑LiCL則可有效抑制這一過程從而抑制METH的神經毒性。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：D919

【參考文獻】

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2 王艷芬;劉志民;;我國“新型毒品”的濫用特征及其危害[J];中國藥物濫用防治雜志;2007年02期

3 劉志民,呂憲祥;我國藥物濫用監(jiān)測概述[J];中國藥物依賴性雜志;2004年01期

4 劉鐵橋,郝偉;苯丙胺類興奮劑概介[J];國外醫(yī)學.精神病學分冊;2001年03期

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本文編號：2680347