【摘要】：研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH),又稱脫氧麻黃堿,屬于苯丙胺類興奮劑(Amphetamine-Typed Stimulant,ATS),其鹽酸鹽為無色透明晶體,外形狀如冰,俗稱“冰毒”,日本化學(xué)家A.Ogata于1919年首次合成。METH作用涉及廣泛,具有興奮中樞神經(jīng)、擬交感、成癮等多種藥理毒理學(xué)特性,長(zhǎng)期吸食者可嚴(yán)重影響其神經(jīng)系統(tǒng)功能。而吸毒所繼發(fā)的各種暴力行為、死亡、復(fù)吸及戒斷性猝死不僅是社會(huì)性的問題也和法醫(yī)工作密切相關(guān)。近年來METH在國(guó)內(nèi)大中城市的濫用情況仍然十分嚴(yán)峻,是繼海洛因之后,危害最為嚴(yán)重和廣泛的毒品,同時(shí)以甲基苯丙胺為主的新型合成毒品種類也逐漸增加濫用人員也呈現(xiàn)迅速的增長(zhǎng)趨勢(shì)。METH可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的丟失及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生,進(jìn)而可能引起多種退行性疾病相關(guān)的病理學(xué)改變,而細(xì)胞骨架的異�？赡芘c包括AD和PD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生及發(fā)展具有很大的關(guān)系。而近年來有文獻(xiàn)報(bào)道GSK3β底物的陣列表明GSK3β是調(diào)節(jié)微管動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵激酶,提示GSK3β激酶可能通過對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)節(jié)參與METH的神經(jīng)毒性損傷過程。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其功能多樣化,在腦組織中普遍表達(dá)并具有廣泛的底物。文獻(xiàn)報(bào)道α-Syn能與細(xì)胞骨架蛋白tau形成聚合體,被tau特異性激酶糖原合成酶激酶3β(GSK3β)磷酸化后,共同參與包括阿爾茨海默病在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病。表明GSK3β可能作為細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的上游調(diào)節(jié)分子蛋白與帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病密切相關(guān)。亦有報(bào)道顯示METH作用后可導(dǎo)致大鼠大腦副核(NAc)核心區(qū)GSK3β活性升高伴有行為學(xué)的明顯改變。本教研室在關(guān)于METH神經(jīng)毒性的前期研究中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,METH可導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞,METH可以通過激活GSK3β引起α-突觸核蛋白(α-synuclein,細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白)的表達(dá)升高及磷酸化水平升高,提示GSK3β在METH所致的細(xì)胞骨架損傷中都扮演了重要角色,并且是關(guān)鍵的一個(gè)靶點(diǎn)。亦有報(bào)道顯示METH作用后可導(dǎo)致大鼠大腦副核(NAc)核心區(qū)GSK3β活性升高伴有行為學(xué)的明顯改變。細(xì)胞骨架是主要由微管、微絲及中間絲三個(gè)部分所組成的蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)體系,對(duì)于維持細(xì)胞正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能行使均起著重要作用。本教研室前期的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,METH中毒大鼠中紋狀體區(qū)神經(jīng)元GSK3β特異性磷酸化產(chǎn)物細(xì)胞骨架蛋白stathmin(op18)表達(dá)明顯升高,提示METH可能通過介導(dǎo)GSK3β活性的變化,影響除了 tau蛋白以外的其他相關(guān)細(xì)胞骨架蛋白。而細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白改變和損傷是神經(jīng)退行性變的病理基礎(chǔ),提示METH所致神經(jīng)元損傷乃至退行性變可能均與METH誘導(dǎo)的GSK3β的活性變化有關(guān),但目前國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果并未闡明相應(yīng)的機(jī)制,需要進(jìn)一步的研究和證實(shí)。本研究擬建立METH中毒細(xì)胞模型,通過形態(tài)學(xué)、免疫熒光、GSK3β及相關(guān)細(xì)胞骨架蛋白等指標(biāo)的檢測(cè),驗(yàn)證METH作用引起GSK3β的活性變化。再通過GSK3β抑制劑(LiCL)進(jìn)一步驗(yàn)證GSK3β的活性變化對(duì)相關(guān)細(xì)胞骨架蛋白的影響,以期對(duì)GSK3β的活性變化而影響細(xì)胞骨架改變的可能調(diào)控機(jī)制和作用進(jìn)行探討,進(jìn)一步闡明METH神經(jīng)毒性作用機(jī)制,為尋找METH神經(jīng)毒性損傷戒毒藥物靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。目的:建立METH的中毒細(xì)胞模型,通過免疫熒光、GSK3β及相關(guān)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白等指標(biāo)的檢測(cè),從而研究METH對(duì)GSK3β活性的影響,以及GSK3β對(duì)后續(xù)相關(guān)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白所起的作用。再通過GSK3β抑制劑(LiCL)反證之前所得的結(jié)果,以進(jìn)一步明確在METH影響下GSK3β活性變化介導(dǎo)的細(xì)胞骨架蛋白變化引起的細(xì)胞骨架重構(gòu),從而深入探究METH神經(jīng)毒性作用機(jī)制,為尋找METH神經(jīng)毒性損傷戒毒藥物新的靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。因此,我們擬研究GSK3β的活性變化對(duì)METH所致細(xì)胞骨架改變的可能調(diào)控機(jī)制和作用的進(jìn)行探討,進(jìn)一步闡明METH神經(jīng)毒性作用機(jī)制。方法:1.在分化的PC12細(xì)胞及神經(jīng)元原代細(xì)胞中建立METH中毒模型(1)先用10%新生胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基于6孔板內(nèi)接種PC12細(xì)胞,并在37℃和5%CO2的敷箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度達(dá)70%時(shí),分別用含 Ommol/L、0.5mmol/L、0.1mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L 濃度 METH 的2%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí),然后提取細(xì)胞總蛋白,用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞磷酸化GSK3β(P-GSK3β)的表達(dá)變化情況,以此綜合并選取合適濃度建立細(xì)胞中毒模型。(2)將新生SD大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞用無胎牛血清(FBS)的專用神經(jīng)元培養(yǎng)基接種6孔板中,細(xì)胞密度以70%為宜,在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng),待培養(yǎng)5-7天神經(jīng)元形態(tài)趨近成熟時(shí),分別用含Ommol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.Ommol/LMETH的無血清神經(jīng)元專用培養(yǎng)基于恒溫敷箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白,再用Western Blot法檢測(cè)磷酸化GSK3β(P-GSK3β)的表達(dá)變化情況,以此綜合并選取合適濃度建立細(xì)胞中毒模型。2.探究GSK3β在METH誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)中的作用機(jī)制分別將PC12細(xì)胞和新生SD大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞分別接種于6孔板中,在37℃和5%C02條件下培養(yǎng)。待PC12細(xì)胞長(zhǎng)至70%匯合時(shí),用含Ommol/L、0.5mmol/L、0.1mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/LMETH 的 2%血清培養(yǎng)基于恒溫敷箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),后提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白;待神經(jīng)元原代細(xì)胞培養(yǎng)5-7天形態(tài)趨近成熟神經(jīng)元時(shí),用含 0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L METH的無血清神經(jīng)元專用培養(yǎng)基于恒溫敷箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白,再用Western Blot法分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白水平的變化情況。接種PC12細(xì)胞及神經(jīng)元原代細(xì)胞分別至6孔板培養(yǎng)皿中并將細(xì)胞分為4組:空白對(duì)照組(CON)、對(duì)照+抑制劑組(LiCL)、給藥組(METH)、給藥+抑制劑組(METH+LiCL),其中在對(duì)照+抑制劑組(LiCL)及給藥+抑制劑組(METH+LiCL)內(nèi)提前加入抑制劑(LiCL)處理30分鐘后,再加入合適濃度的METH進(jìn)行給藥處理,分別培養(yǎng)24小時(shí)后,收集細(xì)胞或細(xì)胞液進(jìn)行以下各項(xiàng)實(shí)驗(yàn):(1)于倒置顯微鏡下觀察各組PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)異常改變。(2)用Western Blot法分別對(duì)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白包括APC、磷酸化的TAU(P-TAU)、磷酸化的 CRMP2(P-CRMP2)、磷酸化的 STATHMIN(P-OP18)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。(3)采用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)微絲以及微管的變化。結(jié)果:1.PC12細(xì)胞及神經(jīng)元原代細(xì)胞中METH中毒模型的建立經(jīng)METH處理后的PC12細(xì)胞以及神經(jīng)元原代細(xì)胞相較空白對(duì)照組GSK3β的磷酸化水平隨METH濃度增加逐漸增高。其中,在PC12細(xì)胞內(nèi),當(dāng)METH濃度大于1.0mmol/L時(shí),磷酸化GSK3β(P-GSK3β)升高與對(duì)照組相比均有顯著性差異(p0.05);而在神經(jīng)元原代細(xì)胞內(nèi),當(dāng)METH濃度大于0.4mmol/L時(shí),P-GSK3β升高與對(duì)照組相比均有顯著性差異(p0.05)。當(dāng)加入2.0 mmol/LGSK3β抑制劑LiCL時(shí),可顯著抑制METH引起的PC12細(xì)胞以及神經(jīng)元原代細(xì)胞內(nèi)GSK3β活性表達(dá)升高.2.探究GSK3β在METH誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)中的作用機(jī)制(1)Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于空白對(duì)照組,經(jīng)METH處理的PC12細(xì)胞以及神經(jīng)元原代細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白包括Tau、CRMP2、OP18的磷酸化水平及APC的表達(dá)均隨METH濃度增加而逐漸增高。(2)4組細(xì)胞模型分別經(jīng)過不同的處理24h后,倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞的形態(tài)變化,可見METH組與CON組的細(xì)胞形態(tài)相比有了明顯改變,可見胞體大體變圓,突起變短甚至消失,部分細(xì)胞脫壁漂浮;CON+LiCL組細(xì)胞形態(tài)與CON組相比無明顯變化;而METH+LiCL組相較于METH組,無論是胞體還是突起損傷均有了明顯的改善。(3)Western Blot法檢測(cè)PC12細(xì)胞以及神經(jīng)元原代細(xì)胞內(nèi)各組細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn):CON+LiCL組細(xì)胞內(nèi)APC總蛋白及TAU、CRMP2、OP18的磷酸化蛋白表達(dá)水平相比于CON組并無明顯變化,METH組細(xì)胞內(nèi)APC總蛋白及TAU、CRMP2、OP18的磷酸化蛋白表達(dá)水平相比于CON組顯著升高(p0.05),而METH+LiCL組細(xì)胞內(nèi)APC總蛋白及TAU、CRMP2、OP18的磷酸化蛋白表達(dá)水平相比于METH組顯著降低(p0.05)。(4)在共聚焦顯微鏡下觀察可見:在PC12細(xì)胞內(nèi),METH組細(xì)胞內(nèi)微絲及微管較CON組排列上有一定程度上的紊亂。而在神經(jīng)元原代細(xì)胞內(nèi),METH組除了胞內(nèi)微絲及微管較CON組排列上的異常變化外還可發(fā)現(xiàn)軸突的縮短及細(xì)胞邊緣毛刺狀的改變。結(jié)論:1.磷酸化的GSK3β在METH處理的PC12細(xì)胞株以及神經(jīng)元原代細(xì)胞內(nèi)表達(dá)顯著上調(diào),且上調(diào)趨勢(shì)隨METH濃度的增高而升高。GSK3β抑制劑LiCL可有效抑制GSK3β磷酸化水平的升高。2.METH可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)GSK3β的磷酸化而引起GSK3β活性水平的升高,活化的GSK3β可以使下游的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白包括APC、TAU、CRMP2、OP18水平升高或發(fā)生磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞骨架的紊亂進(jìn)而重構(gòu),引起神經(jīng)元退行性變。GSK3β抑制劑LiCL則可有效抑制這一過程從而抑制METH的神經(jīng)毒性。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：D919

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2680347