【摘要】：一、研究背景放射性肺損傷(Radiation-induced lung injury,RILI)是核戰(zhàn)爭(zhēng)、核與放射事故、核恐怖襲擊等大劑量受照人員最常見的也是最嚴(yán)重的放射損傷之一,是導(dǎo)致放射損傷傷員死亡的重要因素。此外,RILI還是胸部腫瘤患者放射治療后常見的并發(fā)癥,胸部腫瘤放療時(shí)有14.6%-37.2%患者伴有放射性肺損傷發(fā)生,這嚴(yán)重限制了腫瘤的治療效果,也影響了患者的生活質(zhì)量。然而,目前臨床上對(duì)RILI的治療尚無十分有效的方法和措施,因此,尋找有效治療RILI藥物或手段,不論在軍事醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還是腫瘤放療方面均具有非常重要的意義和應(yīng)用前景。放射性肺損傷包括急性期的放射性肺炎和慢性期的放射性肺纖維化兩個(gè)階段。RILI發(fā)生機(jī)制目前主要有以下幾種學(xué)說:靶細(xì)胞學(xué)說、細(xì)胞因子學(xué)說,以及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)學(xué)說。根據(jù)RILI的發(fā)生機(jī)制,現(xiàn)在臨床上的治療藥物主要包括:針對(duì)減輕炎癥的糖皮質(zhì)激素,清除氧化自由基的抗氧化類藥物以及細(xì)胞因子抑制劑等。這些藥物在放射性肺損傷的治療中發(fā)揮了積極的作用,但由于RILI發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,影響因素多,目前的治療藥物難以針對(duì)發(fā)病機(jī)制中的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用,因此還不能達(dá)到理想的治療效果。近年來,間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的研究為RILI的治療提供了新的思路和策略。MSCs是具有高度自我更新、多向分化潛能的多能干細(xì)胞,又因其免疫原性低、易獲得和便于體外擴(kuò)增的特點(diǎn),受到廣泛的關(guān)注,在多種疾病中均顯示了其較好的治療效果,如心衰、肝損傷、皮膚損傷等。在放射性肺損傷治療應(yīng)用中,也有一些研究進(jìn)行了有益的嘗試,取得了一定的治療效果。由于RILI不同于其它因素造成的組織損傷,電離輻射通過產(chǎn)生大量自由基導(dǎo)致的組織損傷環(huán)境以及局部的肺組織缺血缺氧的條件,嚴(yán)重限制了外源性MSCs的歸巢以及在受損組織的停留,致使其發(fā)揮作用時(shí)間短,治療效果欠佳,尤其是對(duì)后期的肺纖維化則無明顯改善作用。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)低氧條件下,MSCs的增殖能力、分化能力明顯加強(qiáng),許多生長(zhǎng)因子表達(dá)大量上調(diào)。特別是發(fā)現(xiàn)低氧影響細(xì)胞最顯著的效應(yīng)分子--乏氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)不僅能夠促進(jìn)胞增殖,增強(qiáng)細(xì)胞活力,還能增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞輻射耐受作用。因此我們推測(cè),低氧培養(yǎng)的MSCs有可能更好耐受局部缺血缺氧的環(huán)境,使更多的MSCs進(jìn)入損傷的肺組織并長(zhǎng)期存活,高增殖、多分化,從而對(duì)RILI發(fā)揮更好治療作用,可能成為RILI新的有效的治療手段�；谝陨系囊罁�(jù)和推測(cè),本課題開展了低氧培養(yǎng)的MSCs對(duì)放射性肺損傷治療作用及機(jī)制研究。重點(diǎn)將小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)進(jìn)行分離、純化,觀察低氧對(duì)BMSCs形態(tài)、增殖、分化的影響以及低氧BMSCs對(duì)ROS和乏氧的耐受性;通過小鼠放射性肺損傷模型,比較低氧BMSCs和常氧BMSCs對(duì)RILI的治療效果;在以上效應(yīng)確定的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步從細(xì)胞水平觀察低氧BMSCs對(duì)受照肺泡上皮細(xì)胞的作用;最后,分別從乏氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)及其相關(guān)信號(hào)通路激活,以及旁分泌功能等方面探討低氧BMSCs對(duì)RILI的治療作用機(jī)制。二、研究?jī)?nèi)容(一)低氧對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響1、比較不同低氧濃度對(duì)BMSCs生長(zhǎng)的影響;2、選擇最佳低氧濃度,觀察低氧對(duì)BMSCs形態(tài)、增殖、分化的影響;3、觀察在低氧條件下培養(yǎng)的BMSCs內(nèi)ROS水平及GSH、SOD的變化;4、研究低氧條件下培養(yǎng)的BMSCs對(duì)ROS和乏氧的耐受性。(二)低氧BMSCs對(duì)小鼠RILI的治療作用1、檢測(cè)低氧BMSCs在RILI小鼠肺組織中的歸巢情況;2、觀察低氧BMSCs對(duì)小鼠RILI的治療效果;3、探討低氧BMSCs對(duì)RILI小鼠免疫細(xì)胞激活及炎癥因子表達(dá)的影響。(三)低氧BMSCs對(duì)受照肺泡上皮細(xì)胞的作用1、觀察低氧BMSCs對(duì)照后肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響,2、探討低氧BMSCs對(duì)照后肺泡上皮細(xì)胞EMT影響,(四)低氧BMSCs治療RILI的分子機(jī)制1、研究HIF1-α、Akt在增強(qiáng)低氧BMSCs凋亡抗性中的作用(1)觀察在重度低氧條件下低氧BMSCs內(nèi)HIF-1α、Akt及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化;(2)抑制HIF-1α表達(dá),進(jìn)一步探討其對(duì)低氧BMSCs內(nèi)Akt及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;(3)抑制HIF-1α表達(dá),探究低氧BMSCs對(duì)乏氧耐受性的變化;2、探討低氧BMSCs是否通過外分泌方式以減輕肺泡上皮細(xì)胞放射損傷的作用(1)利用抗體芯片篩選常氧和低氧BMSCs分泌蛋白的差異,尋找在減輕肺泡上皮細(xì)胞放射損傷中的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白;(2)驗(yàn)證抗體芯片篩選出的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白,進(jìn)一步確認(rèn)低氧BMSCs外分泌方式在減輕肺泡上皮細(xì)胞放射損傷的作用機(jī)制。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(一)低氧能夠改變BMSCs生物學(xué)特性,提高對(duì)ROS和乏氧的耐受性低氧(氧濃度2.5%)可促進(jìn)BMSC細(xì)胞生長(zhǎng),提高BMSCs的活性和增殖能力,加速BMSCs向成骨、成脂分化,促進(jìn)其成熟;低氧能夠增加BMSCs內(nèi)的GSH、SOD含量,降低BMSCs內(nèi)ROS的水平;低氧BMSCs較常氧BMSCs具有更強(qiáng)的抗ROS能力和對(duì)嚴(yán)重低氧的耐受性。(二)低氧BMSCs能夠顯著減輕小鼠放射性肺損傷低氧BMSCs比常氧BMSCs在RILI小鼠肺組織中具有更強(qiáng)的“歸巢”能力,更長(zhǎng)的存活時(shí)間;低氧BMSCs相較于常氧BMSCs更能減少受照后小鼠肺組織早期炎癥滲出,減輕肺泡壁增厚程度,降低肺組織中α-SMA陽性率,下調(diào)α-SMA表達(dá),抑制了后期肺纖維化的進(jìn)一步發(fā)展;低氧BMSCs能夠抑制受照后小鼠免疫細(xì)胞的激活,顯著減少肺組織內(nèi)巨噬細(xì)胞趨化、聚集數(shù)量,降低外周血TNF-α、TGF-β水平,使外周血INF-γ水平呈現(xiàn)出先抑后升的趨勢(shì)。(三)低氧BMSCs可減輕受照肺泡上皮細(xì)胞損傷通過在體和離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低氧BMSCs能顯著減少受照小鼠肺泡上皮細(xì)胞的凋亡;肺泡上皮細(xì)胞(RLE-6TN)照射后與低氧BMSCs共培養(yǎng),RLE-6TN細(xì)胞的E-adherin表達(dá)明顯上調(diào),同時(shí)Vimentin表達(dá)明顯下調(diào),表現(xiàn)出較強(qiáng)強(qiáng)的抑制EMT作用。(四)低氧BMSCs治療RILI的分子機(jī)制1、低氧能夠誘導(dǎo)HIF-1α上調(diào),抑制線粒體途徑凋亡通路的激活,進(jìn)而提高了低氧BMSCs。低氧BMSCs中HIF-1α、Akt本底表達(dá)量顯著高于常氧BMSCs,重度低氧(1%O_2)處理后,常氧BMSCs細(xì)胞HIF-1α、P-Akt473及Caspase-3表達(dá)逐漸升高,但低氧BMSCs上述三項(xiàng)則無顯著改變;抑制HIF-1α表達(dá),重度低氧條件下低氧BMSCs的Caspase-3表達(dá)明顯上調(diào),Akt的表達(dá)并無明顯影響,但細(xì)胞活力顯著降低。以上結(jié)果表明,HIF-1α介導(dǎo)了低氧BMSCs對(duì)嚴(yán)重低氧的抗性。2、低氧BMSCs通過外分泌方式減輕放射性肺損傷利用抗體芯片篩選差異倍數(shù)大于1.5和小于0.67,p值小于0.05的蛋白一共23種,其中在低氧BMSCs中高表達(dá)的有:GM-CSF、IL-4、IL-13、IL-17、MIP-1a、CD27、DtK、MIP-1b,差異倍數(shù)最大的是IL-13(Log2FC=2.226)、MIP-1b(Log2FC=2.071)、MIP-1a(Log2FC=1.380);對(duì)分泌蛋白進(jìn)行KEGG分析,發(fā)現(xiàn)有顯著差異的信號(hào)通路主要有Jak-STAT通路、IL-17通路、NF-κB通路、TNF通路、MAPK通路;對(duì)以上在低氧BMSCs中高表達(dá)的IL-13、MIP-1a、MIP-1b利用ELISA方法進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果符合芯片篩選結(jié)果,在低氧BMSCs中IL-13、MIP-1a、MIP-1b的蛋白表達(dá)量均較常氧BMSCs顯著增多。結(jié)果提示,低氧BMSCs通過外分泌方式減輕放射性肺損傷,作為效應(yīng)蛋白IL-13、MIP-1a、MIP-1b可能在其中發(fā)揮重要作用。四、討論與分析放射性肺損傷不同于其它因素造成的肺組織損傷,電離輻射通過產(chǎn)生大量自由基導(dǎo)致的組織損傷環(huán)境以及局部的肺組織缺血缺氧的條件,嚴(yán)重影響目前臨床藥物的治療效果。近年來研究表明MSCs在多種疾病治療中均顯示出較好的效果,并且發(fā)現(xiàn),低氧條件下MSCs具有更強(qiáng)的增殖、分化能力,特別是發(fā)現(xiàn)低氧影響細(xì)胞最顯著的的效應(yīng)分子--乏氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)不僅能夠促進(jìn)胞增殖,增強(qiáng)細(xì)胞活力,還能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)輻射耐受作用。因此,我們首先從動(dòng)物水平證實(shí)了低氧BMSCs比常氧BMSCs對(duì)RILI具有更好的治療作用,并發(fā)現(xiàn)該作用的實(shí)現(xiàn)主要依賴于兩個(gè)方面:一是低氧培養(yǎng)的BMSCs較常氧BMSCs增殖旺盛,具有較強(qiáng)的“歸巢”能力和在受損肺組織更長(zhǎng)的停留時(shí)間,獲得了對(duì)ROS和重度低氧環(huán)境的抗性,這是其治療RILI的基礎(chǔ)。另一方面是低氧BMSCs通過對(duì)肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞產(chǎn)生作用,進(jìn)而產(chǎn)生抗凋亡、抑制免疫、阻滯EMT的效應(yīng)。其次對(duì)低氧BMSCs治療RILI的分子機(jī)制從兩方面開展了研究,1、通過WB等技術(shù),檢測(cè)在低氧環(huán)境下,BMSCs效應(yīng)分子以及相關(guān)信號(hào)通路激活的變化,并通過抑制劑干擾相關(guān)蛋白,反向驗(yàn)證效應(yīng)分子及其通路;2、利用蛋白芯片篩選常氧BMSCs和低氧BMSCs差異表達(dá)的外分泌蛋白,并通過ELISA進(jìn)行驗(yàn)證,明確其主要作用的效應(yīng)蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn),低氧能夠誘導(dǎo)BMSCs內(nèi)HIF-1α上調(diào),抑制線粒體途徑凋亡通路的激活,從而提高低氧BMSCs對(duì)嚴(yán)重低氧的耐受性;另一方面低氧BMSCs是通過外分泌方式減輕放射性肺損傷,其主要作用的效應(yīng)蛋白IL-13、MIP-1a、MIP-1b可能在其中發(fā)揮重要作用。五、研究結(jié)論低氧更能促進(jìn)BMSCs增殖和歸巢,提高抗ROS能力和嚴(yán)重低氧的耐受性;低氧BMSCs能夠顯著減少受照射肺泡細(xì)胞凋亡,抑制輻射所致的肺泡細(xì)胞EMT的發(fā)生,明顯減輕照后小鼠肺組織炎癥程度,抑制后期肺纖維化的形成,對(duì)小鼠RILI具有較好的治療作用。其作用機(jī)制:一方面是通過低氧誘導(dǎo)HIF-1α上調(diào),進(jìn)而抑制了線粒體途徑凋亡通路的激活,發(fā)揮了抗肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用;另一方面低氧BMSCs是通過外分泌方式減輕放射性肺損傷,其主要作用效應(yīng)蛋白IL-13、MIP-1a、MIP-1b可能在其中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

統(tǒng)計(jì)學(xué)意義二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一）BMSCs 制備及鑒定 6 周齡 C57BL6/J 小鼠的股骨進(jìn)行取材，采用全骨髓貼壁法/貼壁篩選用的 BMSCs ，然后用 CD45、CD34、CD105、CD90 標(biāo)記，通過流到的 BMSCs 進(jìn)行表面標(biāo)志鑒定，通過成骨、成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)鑒定 分化潛能。結(jié)果顯示： BMSCs 的 CD45、CD34、CD105、CD90 陽3.94±1.87%，3.07±1.29%，70.99±4.67%，67.77±7.79%（圖 1-1-1）Cs 表面標(biāo)志物 CD34、CD45 呈陰性，CD105、CD90 呈陽性。分化實(shí)Cs 具有成骨、成脂肪分化的能力（圖 1-1-2）。以上結(jié)果體現(xiàn)我們Cs 符合大多數(shù)文獻(xiàn)的報(bào)道，說明分離、培養(yǎng)得到的細(xì)胞為 BMSCs。

（二）不同氧濃度對(duì) BMSCs 生長(zhǎng)的影響將全骨髓貼壁法/貼壁篩選法分離培養(yǎng) BMSCs，，分別置于常氧（氧濃度 21%）和低氧（氧濃度 1%、2.5%、5%）條件下進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)七天觀察其生長(zhǎng)情況并進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示：1%O2條件下培養(yǎng)的 BMSCs 細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，于第 4 天減少至0.74×104；2.5%O2和 5%O2條件下培養(yǎng)的 BMSCs 前 3 天處于生長(zhǎng)抑制狀態(tài)，但第 4天開始細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)急劇上升，在第 5 天時(shí) 2.5%O2培養(yǎng)的 BMSCs 數(shù)量甚至超過了常氧培養(yǎng)的 BMSCs（圖 1-2）。以上結(jié)果說明，一定程度的低氧條件（2.5%O2，5%O2）能夠促進(jìn) BMSCs 的生長(zhǎng)，特別是在 2.5%O2的培養(yǎng)條件下對(duì)促進(jìn) MSCs 生長(zhǎng)效果最圖 1-1-2 BMSCs 成脂、成骨誘導(dǎo)分化情況
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R818.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2662295