【摘要】:目的: 通過與真核表達載體pVAX1的重組,構(gòu)建大鼠腎上腺髓質(zhì)素真核表達質(zhì)粒(pVAX1-ADM)。采取肌肉注射法將不同劑量的重組質(zhì)粒導入大鼠后肢腓腸肌內(nèi),建立大鼠力竭缺氧模型,研究重組大鼠腎上腺髓質(zhì)素質(zhì)粒對力竭運動大鼠心臟缺氧的保護作用。 方法: 1.構(gòu)建重組大鼠腎上腺髓質(zhì)素質(zhì)粒(pVAX1-ADM):提取SD雄性大鼠腎上腺組織總RNA,通過RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄法獲得ADM基因的cDNA,進一步擴增cDNA模板并克隆至PMD-18T載體,將克隆產(chǎn)物亞克隆至真核表達載體pVAX1上最終獲得重組產(chǎn)物pVAX1-ADM。采取堿性裂解法和聚乙二醇法反復大量提取足夠濃度及純度的重組質(zhì)粒。 2.雄性SD大鼠18只,體重(203±18.4)g,根據(jù)體重完全隨機分為3組,6只/組,分別為正常對照組、空載體組和pVAX1-ADM700μ g/kg組。3組大鼠分別注射生理鹽水1ml、pVAX1質(zhì)粒DNA生理鹽水溶液1ml和700μg/kg劑量pVAX1-ADM生理鹽水溶液1ml,1次/周,共注射4周。模型建立完成后,通過免疫組織化學方法對所取大鼠心肌組織進行重組質(zhì)粒pVAX1-ADM的表達情況進行檢測。 3.不同劑量pVAX1-ADM對力竭大鼠心臟的保護作用:雄性SD大鼠48只,體重(223.24±23.77) g,按體重隨機分為6組,8只/組,分別為正常對照組(C組)、力竭對照組(Ex組)、還原型谷胱甘肽陽性藥物組(G組),pVAX1-ADM700μ g/kg劑量組(P1組)、pVAX1-ADM1100μ g/kg劑量組(P2組)、pVAX1-ADM1400μ g/kg劑量組(P3組)。除正常對照組外,其余5組根據(jù)大鼠力竭心臟缺氧模型進行一次力竭性運動。每周給C組、Ex組注射生理鹽水1ml,G組注射還原型谷胱甘肽(GSH)0.125g/ml生理鹽水溶液1ml,P1、P2、P3組分別注射pVAX1-ADM700μ g/kg、1100μg/kg和1400μ g/kg生理鹽水溶液1ml。第四周大鼠運動至完全力竭后,取大鼠心肌組織測定組織中CK、LDH、MDA及SOD的水平,并對心肌組織作組織形態(tài)學觀察,同時收集大鼠血液作血漿粘度、紅細胞聚集指數(shù)、紅變形指數(shù)等血流變指數(shù)檢測。 結(jié)果: 1.通過與Genebank中所查詢的ADM基因序列比較,證實所構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA序列與之完全一致。同時,經(jīng)過Xba I與HindⅢ雙酶切鑒定,結(jié)果為陽性。通過紫外分光光度法測定經(jīng)大量提取純化后的重組質(zhì)粒的純度為:OD260=0.924,OD280=0.505,OD260/OD280=1.828,濃度為4.63mg/ml。 2.通過對大鼠腓腸肌組織的組織形態(tài)學切片觀察,結(jié)果顯示正常對照組、空載體組心肌組織ADM表達量較低,而pVAXl-ADM700μ g/kg組表達量較高。 3.大鼠心肌組織的MDA、T-SOD、CK和LDH的最終檢測結(jié)果顯示,相對于Ex組,P1組、P2組、P3組和G組的CK、LDH和MDA含量均明顯降低(P<0.05),指標結(jié)果具有顯著性差異(P<0.05),有統(tǒng)計學意義;T-SOD含量明顯增加(P<0.05),指標結(jié)果具有顯著性差異(P<0.05),有統(tǒng)計學意義。組織形態(tài)學檢測表明與C組相比較,Ex組心肌組織結(jié)構(gòu)損壞嚴重,炎性細胞聚集,水腫明顯。相較于Ex組,P1組、P2組、P3組和G組心肌組織結(jié)構(gòu)損傷情況均得到明顯減緩,組織水腫情況有所減輕。大鼠血液血流變檢測結(jié)果顯示,P1組、P2組、P3組和G組的全血高切粘度、全血低切粘度、血漿粘度、紅細胞聚集指數(shù)和紅細胞變形指數(shù)都比Ex組有明顯降低(P<0.05),指標結(jié)果之間的差異具有統(tǒng)計學意義;紅細胞壓積較Ex組的有明顯升高(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建大鼠pVAXl-ADM重組質(zhì)粒,通過大量提取純化所獲質(zhì)粒DNA的純度及濃度均符合后續(xù)實驗要求。 2.700μ g/kg重組質(zhì)粒導入大鼠腓腸肌后能使大鼠腓腸肌組織中的ADM表達量上調(diào),以上表明重組大鼠腎上腺髓質(zhì)素真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功,可在大鼠體內(nèi)正常攝入并表達。 3.700μ g/kg、1100μ g/kg、1400μ g/kgpVAXl-ADM和陽性藥物GSH導入后都可提高力竭性運動大鼠心肌組織的SOD活力,降低MDA含量,降低心肌組織內(nèi)CK活力和LDH含量,改善血流狀況,對力竭性運動大鼠的心臟有保護作用且具有一定劑量效應(yīng),其中以1400μg/kg pVAXl-ADM的效果最好。
[Abstract]:......
【學位授予單位】:湖南師范大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2012
【分類號】:R87
【參考文獻】
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2390933
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