【摘要】：目的： 通過與真核表達(dá)載體pVAX1的重組,構(gòu)建大鼠腎上腺髓質(zhì)素真核表達(dá)質(zhì)粒(pVAX1-ADM)。采取肌肉注射法將不同劑量的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大鼠后肢腓腸肌內(nèi),建立大鼠力竭缺氧模型,研究重組大鼠腎上腺髓質(zhì)素質(zhì)粒對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心臟缺氧的保護(hù)作用。 方法： 1.構(gòu)建重組大鼠腎上腺髓質(zhì)素質(zhì)粒(pVAX1-ADM):提取SD雄性大鼠腎上腺組織總RNA,通過RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄法獲得ADM基因的cDNA,進(jìn)一步擴(kuò)增cDNA模板并克隆至PMD-18T載體,將克隆產(chǎn)物亞克隆至真核表達(dá)載體pVAX1上最終獲得重組產(chǎn)物pVAX1-ADM。采取堿性裂解法和聚乙二醇法反復(fù)大量提取足夠濃度及純度的重組質(zhì)粒。 2.雄性SD大鼠18只,體重(203±18.4)g,根據(jù)體重完全隨機(jī)分為3組,6只／組,分別為正常對(duì)照組、空載體組和pVAX1-ADM700μ g/kg組。3組大鼠分別注射生理鹽水1ml、pVAX1質(zhì)粒DNA生理鹽水溶液1ml和700μg/kg劑量pVAX1-ADM生理鹽水溶液1ml,1次／周,共注射4周。模型建立完成后,通過免疫組織化學(xué)方法對(duì)所取大鼠心肌組織進(jìn)行重組質(zhì)粒pVAX1-ADM的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。 3.不同劑量pVAX1-ADM對(duì)力竭大鼠心臟的保護(hù)作用：雄性SD大鼠48只,體重(223.24±23.77) g,按體重隨機(jī)分為6組,8只／組,分別為正常對(duì)照組(C組)、力竭對(duì)照組(Ex組)、還原型谷胱甘肽陽性藥物組(G組),pVAX1-ADM700μ g/kg劑量組(P1組)、pVAX1-ADM1100μ g/kg劑量組(P2組)、pVAX1-ADM1400μ g/kg劑量組(P3組)。除正常對(duì)照組外,其余5組根據(jù)大鼠力竭心臟缺氧模型進(jìn)行一次力竭性運(yùn)動(dòng)。每周給C組、Ex組注射生理鹽水1ml,G組注射還原型谷胱甘肽(GSH)0.125g/ml生理鹽水溶液1ml,P1、P2、P3組分別注射pVAX1-ADM700μ g/kg、1100μg/kg和1400μ g/kg生理鹽水溶液1ml。第四周大鼠運(yùn)動(dòng)至完全力竭后,取大鼠心肌組織測(cè)定組織中CK、LDH、MDA及SOD的水平,并對(duì)心肌組織作組織形態(tài)學(xué)觀察,同時(shí)收集大鼠血液作血漿粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅變形指數(shù)等血流變指數(shù)檢測(cè)。 結(jié)果： 1.通過與Genebank中所查詢的ADM基因序列比較,證實(shí)所構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA序列與之完全一致。同時(shí),經(jīng)過Xba I與HindⅢ雙酶切鑒定,結(jié)果為陽性。通過紫外分光光度法測(cè)定經(jīng)大量提取純化后的重組質(zhì)粒的純度為：OD260=0.924,OD280=0.505,OD260/OD280=1.828,濃度為4.63mg/ml。 2.通過對(duì)大鼠腓腸肌組織的組織形態(tài)學(xué)切片觀察,結(jié)果顯示正常對(duì)照組、空載體組心肌組織ADM表達(dá)量較低,而pVAXl-ADM700μ g/kg組表達(dá)量較高。 3.大鼠心肌組織的MDA、T-SOD、CK和LDH的最終檢測(cè)結(jié)果顯示,相對(duì)于Ex組,P1組、P2組、P3組和G組的CK、LDH和MDA含量均明顯降低(P＜0.05),指標(biāo)結(jié)果具有顯著性差異(P＜0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；T-SOD含量明顯增加(P＜0.05),指標(biāo)結(jié)果具有顯著性差異(P＜0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)表明與C組相比較,Ex組心肌組織結(jié)構(gòu)損壞嚴(yán)重,炎性細(xì)胞聚集,水腫明顯。相較于Ex組,P1組、P2組、P3組和G組心肌組織結(jié)構(gòu)損傷情況均得到明顯減緩,組織水腫情況有所減輕。大鼠血液血流變檢測(cè)結(jié)果顯示,P1組、P2組、P3組和G組的全血高切粘度、全血低切粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞變形指數(shù)都比Ex組有明顯降低(P＜0.05),指標(biāo)結(jié)果之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；紅細(xì)胞壓積較Ex組的有明顯升高(P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建大鼠pVAXl-ADM重組質(zhì)粒,通過大量提取純化所獲質(zhì)粒DNA的純度及濃度均符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。 2.700μ g/kg重組質(zhì)粒導(dǎo)入大鼠腓腸肌后能使大鼠腓腸肌組織中的ADM表達(dá)量上調(diào),以上表明重組大鼠腎上腺髓質(zhì)素真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,可在大鼠體內(nèi)正常攝入并表達(dá)。 3.700μ g/kg、1100μ g/kg、1400μ g/kgpVAXl-ADM和陽性藥物GSH導(dǎo)入后都可提高力竭性運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織的SOD活力,降低MDA含量,降低心肌組織內(nèi)CK活力和LDH含量,改善血流狀況,對(duì)力竭性運(yùn)動(dòng)大鼠的心臟有保護(hù)作用且具有一定劑量效應(yīng),其中以1400μg/kg pVAXl-ADM的效果最好。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R87

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2390933