【摘要】：腸上皮組織作為機體的防御屏障之一,對抵御病原體及有害因子入侵起著重要作用。小腸上皮細胞更新迅速,對電離輻射十分敏感,由此造成的小腸結(jié)構(gòu)和功能損傷的確切機制尚不清楚,從而制約了腸道輻射損傷的救治,也是腹部腫瘤放射治療領(lǐng)域研究的重要課題。業(yè)已表明,電離輻射造成的腸隱窩干細胞及其干細胞龕損傷是腸損傷難以救治的關(guān)鍵機制。盡管目前已發(fā)現(xiàn)多種防護藥物,如TLRs激動劑等,但如何維持腸區(qū)域穩(wěn)態(tài)和保護腸干細胞機制尚不明了。共刺激分子及其介導(dǎo)的共刺激分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在免疫應(yīng)答中起到了至關(guān)重要的作用。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)了一群介導(dǎo)免疫下調(diào)的負性分子,稱之為免疫卡控點(Immune Checkpoints),包括B7H1、B7H3、B7H4等,起到維持免疫穩(wěn)態(tài)為主的調(diào)節(jié)作用,并已證實可表達于多種免疫細胞及腫瘤組織中,介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)小腸組織表達B7H1和B7H4分子,但具體作用尚不清楚。鑒于此,本文以B7H1和B7H4分子在不同發(fā)育階段小鼠腸道的表達規(guī)律及其與干細胞的相關(guān)性為研究基礎(chǔ),建立不同劑量照射造成的腸損傷模型,并采用TLR5激動劑CBLB502進行預(yù)防性干預(yù),觀測B7H1和B7H4分子在輻射損傷不同階段腸組織中的表達及對干細胞的影響,以探討輻射性腸損傷的生物學(xué)機制并尋找新的干預(yù)措施。第一部分B7H1和B7H4分子在小鼠不同發(fā)育階段腸組織的表達目的分析B7H1和B7H4分子在C57BL/6J和Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠不同發(fā)育階段腸道中的表達規(guī)律及其與腸干細胞的相關(guān)性。方法分別取出生0 w、1 w、3 w、6 w、9 w小鼠小腸和大腸,通過免疫組化觀察B7H1和B7H4分子表達水平,進而通過免疫熒光探究其表達位置;并采用Lgr5-EGFP-ires-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠觀察B7H1和B7H4分子的表達與Lgr5干細胞存在何種相關(guān)性;結(jié)果(1)B7H1和B7H4分子均自3 w開始表達于小腸(空腸、回腸)隱窩底部;(2)免疫熒光表明B7H1位于潘氏細胞內(nèi),B7H4位于潘氏細胞胞膜上,兩者均不表達于Lgr5干細胞中;(3)結(jié)直腸組織未見B7H1和B7H4分子表達。結(jié)論本部分研究分別采用野生型c57和lgr5-egfp小鼠,明確了b7h1和b7h4分子在腸道表達的規(guī)律及表達位置,從而為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分b7h1和b7h4分子在輻射性腸損傷中的表達及意義目的建立不同劑量照射所致的腸損傷模型,觀察b7h1和b7h4分子的表達及其與腸損傷的相關(guān)性。方法將6~8wc57bl/6j小鼠分為對照、2gy、5gy、8gy、11gy照射組,給予照射組小鼠200cgy/min的x射線全身照射,取照后不同時間點(6h、1d、3d、5d、7d、10d、14d)的小鼠空、回腸樣本,通過he染色觀察小腸損傷程度;通過免疫組化和免疫熒光觀察正常和受照小腸中b7h1和b7h4的表達水平變化。結(jié)果(1)2gy和5gy照射后3~5d小腸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,至7d結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常,但5gy照射組恢復(fù)緩慢;8gy照射后小鼠存活時間縮短;小腸損傷7d開始恢復(fù);11gy照射后3d小鼠全部死亡,呈現(xiàn)不可逆性損傷;(2)2gy照射后b7h1和b7h4分子在小腸隱窩組織表達未見明顯變化;5gy照射3d后b7h1分子小腸隱窩組織潘氏細胞的表達下降,但隨著小腸上皮損傷修復(fù)時(7d)還呈現(xiàn)表達,b7h4分子在照射后5d表達減少,未能見恢復(fù)性表達;(3)大劑量(8、11gy)照射后1~3d時b7h1和b7h4分子在小腸組織的表達明顯減少,由于大劑量照射所導(dǎo)致小鼠全部死亡,未能觀察到b7h1和b7h4分子表達的進一步變化。結(jié)論分別建立了不同劑量照射所造成的腸損傷模型,明確了小劑量照射后b7h1逐漸減少并隨小腸結(jié)構(gòu)的恢復(fù)而逐漸表達,同時明確了b7h4分子在5gy照射后未能恢復(fù)性表達,確切的機制仍需進一步的探討;大劑量照射后b7h1和b7h4分子明顯減少,小腸損傷不可逆,表明免疫卡控點參與輻射所致腸穩(wěn)態(tài)失衡及損傷修復(fù)過程。第三部分b7h1和b7h4分子在tlr5激動劑cblb502對輻射性腸損目的采用tlr5激動劑cblb502對不同劑量造成的腸損傷進行預(yù)防性干預(yù),觀察b7h1和b7h4分子的表達變化及其對干細胞的作用。方法將lgr5-egfp小鼠及c57bl/6j小鼠分為對照、照射組及cblb502照射組,通過免疫熒光和Western Blotting檢測小腸干細胞凋亡、增殖、B7H1和B7H4分子的表達變化。結(jié)果(1)照射前0.5 h腹腔注射CBLB502可使7 Gy X射線照射小鼠全部存活,明顯提高9 Gy、10 Gy全身照射小鼠的存活率和體重;(2)照射前0.5 h注射CBLB502明顯減少小腸上皮細胞及干細胞的凋亡,促進其增殖。(3)照射前0.5 h注射CBLB502顯著地上調(diào)B7H1和B7H4分子在潘氏細胞中的表達,與腸輻射損傷存在相關(guān)性。結(jié)論證實了照射前0.5 h采用TLR5激動劑CBLB502對不同劑量照射所造成的腸損傷進行干預(yù)可上調(diào)B7H1和B7H4分子的表達,提示CBLB502對腸輻射損傷的防護可能與上調(diào)表達B7H1和B7H4分子,維護組織穩(wěn)態(tài),促進損傷修復(fù)相關(guān)。綜上所述,本文明確了B7H1和B7H4分子在發(fā)育不同階段小鼠腸道的表達規(guī)律及其與干細胞的相關(guān)性。并在此基礎(chǔ)上建立了不同劑量照射造成的腸損傷模型,繼而采用TLR5激動劑CBLB502進行預(yù)防性干預(yù),觀測到小劑量照射后B7H1逐漸減少并隨小腸結(jié)構(gòu)恢復(fù)逐漸表達,而B7H4分子在5 Gy照射后未能恢復(fù)性表達,大劑量照射后B7H1和B7H4分子明顯減少,小腸損傷不可逆。采用TLR5激動劑CBLB502對不同劑量照射所造成的腸損傷進行干預(yù)可上調(diào)B7H1和B7H4分子的表達,提示CBLB502對腸輻射損傷的防護可能通過上調(diào)表達B7H1和B7H4分子,明顯減少小腸上皮細胞及干細胞的凋亡,促進其增殖從而提高照射小鼠的存活率和體重�？梢娯撔怨泊碳し肿覤7H1和B7H4可維持小腸區(qū)域穩(wěn)態(tài)、保護小腸干細胞免受免疫攻擊,同時促進輻射所致腸損傷的修復(fù)過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R818
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本文編號：
2261773
