【摘要】：腸上皮組織作為機(jī)體的防御屏障之一,對抵御病原體及有害因子入侵起著重要作用。小腸上皮細(xì)胞更新迅速,對電離輻射十分敏感,由此造成的小腸結(jié)構(gòu)和功能損傷的確切機(jī)制尚不清楚,從而制約了腸道輻射損傷的救治,也是腹部腫瘤放射治療領(lǐng)域研究的重要課題。業(yè)已表明,電離輻射造成的腸隱窩干細(xì)胞及其干細(xì)胞龕損傷是腸損傷難以救治的關(guān)鍵機(jī)制。盡管目前已發(fā)現(xiàn)多種防護(hù)藥物,如TLRs激動(dòng)劑等,但如何維持腸區(qū)域穩(wěn)態(tài)和保護(hù)腸干細(xì)胞機(jī)制尚不明了。共刺激分子及其介導(dǎo)的共刺激分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在免疫應(yīng)答中起到了至關(guān)重要的作用。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)了一群介導(dǎo)免疫下調(diào)的負(fù)性分子,稱之為免疫卡控點(diǎn)(Immune Checkpoints),包括B7H1、B7H3、B7H4等,起到維持免疫穩(wěn)態(tài)為主的調(diào)節(jié)作用,并已證實(shí)可表達(dá)于多種免疫細(xì)胞及腫瘤組織中,介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)小腸組織表達(dá)B7H1和B7H4分子,但具體作用尚不清楚。鑒于此,本文以B7H1和B7H4分子在不同發(fā)育階段小鼠腸道的表達(dá)規(guī)律及其與干細(xì)胞的相關(guān)性為研究基礎(chǔ),建立不同劑量照射造成的腸損傷模型,并采用TLR5激動(dòng)劑CBLB502進(jìn)行預(yù)防性干預(yù),觀測B7H1和B7H4分子在輻射損傷不同階段腸組織中的表達(dá)及對干細(xì)胞的影響,以探討輻射性腸損傷的生物學(xué)機(jī)制并尋找新的干預(yù)措施。第一部分B7H1和B7H4分子在小鼠不同發(fā)育階段腸組織的表達(dá)目的分析B7H1和B7H4分子在C57BL/6J和Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠不同發(fā)育階段腸道中的表達(dá)規(guī)律及其與腸干細(xì)胞的相關(guān)性。方法分別取出生0 w、1 w、3 w、6 w、9 w小鼠小腸和大腸,通過免疫組化觀察B7H1和B7H4分子表達(dá)水平,進(jìn)而通過免疫熒光探究其表達(dá)位置;并采用Lgr5-EGFP-ires-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠觀察B7H1和B7H4分子的表達(dá)與Lgr5干細(xì)胞存在何種相關(guān)性;結(jié)果(1)B7H1和B7H4分子均自3 w開始表達(dá)于小腸(空腸、回腸)隱窩底部;(2)免疫熒光表明B7H1位于潘氏細(xì)胞內(nèi),B7H4位于潘氏細(xì)胞胞膜上,兩者均不表達(dá)于Lgr5干細(xì)胞中;(3)結(jié)直腸組織未見B7H1和B7H4分子表達(dá)。結(jié)論本部分研究分別采用野生型c57和lgr5-egfp小鼠,明確了b7h1和b7h4分子在腸道表達(dá)的規(guī)律及表達(dá)位置,從而為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分b7h1和b7h4分子在輻射性腸損傷中的表達(dá)及意義目的建立不同劑量照射所致的腸損傷模型,觀察b7h1和b7h4分子的表達(dá)及其與腸損傷的相關(guān)性。方法將6~8wc57bl/6j小鼠分為對照、2gy、5gy、8gy、11gy照射組,給予照射組小鼠200cgy/min的x射線全身照射,取照后不同時(shí)間點(diǎn)(6h、1d、3d、5d、7d、10d、14d)的小鼠空、回腸樣本,通過he染色觀察小腸損傷程度;通過免疫組化和免疫熒光觀察正常和受照小腸中b7h1和b7h4的表達(dá)水平變化。結(jié)果(1)2gy和5gy照射后3~5d小腸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,至7d結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常,但5gy照射組恢復(fù)緩慢;8gy照射后小鼠存活時(shí)間縮短;小腸損傷7d開始恢復(fù);11gy照射后3d小鼠全部死亡,呈現(xiàn)不可逆性損傷;(2)2gy照射后b7h1和b7h4分子在小腸隱窩組織表達(dá)未見明顯變化;5gy照射3d后b7h1分子小腸隱窩組織潘氏細(xì)胞的表達(dá)下降,但隨著小腸上皮損傷修復(fù)時(shí)(7d)還呈現(xiàn)表達(dá),b7h4分子在照射后5d表達(dá)減少,未能見恢復(fù)性表達(dá);(3)大劑量(8、11gy)照射后1~3d時(shí)b7h1和b7h4分子在小腸組織的表達(dá)明顯減少,由于大劑量照射所導(dǎo)致小鼠全部死亡,未能觀察到b7h1和b7h4分子表達(dá)的進(jìn)一步變化。結(jié)論分別建立了不同劑量照射所造成的腸損傷模型,明確了小劑量照射后b7h1逐漸減少并隨小腸結(jié)構(gòu)的恢復(fù)而逐漸表達(dá),同時(shí)明確了b7h4分子在5gy照射后未能恢復(fù)性表達(dá),確切的機(jī)制仍需進(jìn)一步的探討;大劑量照射后b7h1和b7h4分子明顯減少,小腸損傷不可逆,表明免疫卡控點(diǎn)參與輻射所致腸穩(wěn)態(tài)失衡及損傷修復(fù)過程。第三部分b7h1和b7h4分子在tlr5激動(dòng)劑cblb502對輻射性腸損目的采用tlr5激動(dòng)劑cblb502對不同劑量造成的腸損傷進(jìn)行預(yù)防性干預(yù),觀察b7h1和b7h4分子的表達(dá)變化及其對干細(xì)胞的作用。方法將lgr5-egfp小鼠及c57bl/6j小鼠分為對照、照射組及cblb502照射組,通過免疫熒光和Western Blotting檢測小腸干細(xì)胞凋亡、增殖、B7H1和B7H4分子的表達(dá)變化。結(jié)果(1)照射前0.5 h腹腔注射CBLB502可使7 Gy X射線照射小鼠全部存活,明顯提高9 Gy、10 Gy全身照射小鼠的存活率和體重;(2)照射前0.5 h注射CBLB502明顯減少小腸上皮細(xì)胞及干細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)其增殖。(3)照射前0.5 h注射CBLB502顯著地上調(diào)B7H1和B7H4分子在潘氏細(xì)胞中的表達(dá),與腸輻射損傷存在相關(guān)性。結(jié)論證實(shí)了照射前0.5 h采用TLR5激動(dòng)劑CBLB502對不同劑量照射所造成的腸損傷進(jìn)行干預(yù)可上調(diào)B7H1和B7H4分子的表達(dá),提示CBLB502對腸輻射損傷的防護(hù)可能與上調(diào)表達(dá)B7H1和B7H4分子,維護(hù)組織穩(wěn)態(tài),促進(jìn)損傷修復(fù)相關(guān)。綜上所述,本文明確了B7H1和B7H4分子在發(fā)育不同階段小鼠腸道的表達(dá)規(guī)律及其與干細(xì)胞的相關(guān)性。并在此基礎(chǔ)上建立了不同劑量照射造成的腸損傷模型,繼而采用TLR5激動(dòng)劑CBLB502進(jìn)行預(yù)防性干預(yù),觀測到小劑量照射后B7H1逐漸減少并隨小腸結(jié)構(gòu)恢復(fù)逐漸表達(dá),而B7H4分子在5 Gy照射后未能恢復(fù)性表達(dá),大劑量照射后B7H1和B7H4分子明顯減少,小腸損傷不可逆。采用TLR5激動(dòng)劑CBLB502對不同劑量照射所造成的腸損傷進(jìn)行干預(yù)可上調(diào)B7H1和B7H4分子的表達(dá),提示CBLB502對腸輻射損傷的防護(hù)可能通過上調(diào)表達(dá)B7H1和B7H4分子,明顯減少小腸上皮細(xì)胞及干細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)其增殖從而提高照射小鼠的存活率和體重�？梢娯�(fù)性共刺激分子B7H1和B7H4可維持小腸區(qū)域穩(wěn)態(tài)、保護(hù)小腸干細(xì)胞免受免疫攻擊,同時(shí)促進(jìn)輻射所致腸損傷的修復(fù)過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R818
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本文編號：
2261773
