本文選題：淋巴毒素α　切入點(diǎn)：核輻射　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：一、研究背景和目的美國Genentech公司早在1996年就發(fā)現(xiàn)野生型淋巴毒素α(Lymphotoxinα,LTα)對(duì)核輻射造成的小鼠骨髓損傷具有保護(hù)作用,但由于在隨后的臨床前動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)野生型LTα可以引起明顯的不良反應(yīng),如嚴(yán)重的毛細(xì)血管滲漏、低血壓和寒戰(zhàn)發(fā)熱等,從而使LTα的應(yīng)用研究未能深入進(jìn)行。本課題組在野生型LTα的基礎(chǔ)上,最初從降低野生型LTα的毒副作用的角度出發(fā),開發(fā)N端缺失27個(gè)氨基酸殘基的LTα衍生物(LTα-27)用于聯(lián)合化療。臨床前動(dòng)物試驗(yàn)表明,LTα-27聯(lián)合化療藥物能夠發(fā)揮明顯的協(xié)同殺傷上皮來源腫瘤的作用,而不會(huì)誘導(dǎo)骨髓來源細(xì)胞凋亡的發(fā)生,反而會(huì)保護(hù)骨髓來源細(xì)胞對(duì)抗化療藥物的細(xì)胞毒作用。但LTα-27在臨床I期階段仍有70%的受試者出現(xiàn)比較嚴(yán)重的寒戰(zhàn)發(fā)熱,限制了它的進(jìn)一步開發(fā),然而令人意外的發(fā)現(xiàn)是臨床I期聯(lián)合使用LTα-27的化療病人,其血小板、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞下降幅度明顯低于單獨(dú)使用化療藥物的患者,即LTα-27顯現(xiàn)出明顯的骨髓/造血細(xì)胞保護(hù)作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)LTα通過與腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor1,TNFR1)和TNFR2結(jié)合,啟動(dòng)下游信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)作用,其中毒副作用主要與TNFR2結(jié)合有關(guān)。因此在此研究基礎(chǔ)上,通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)篩選,得到與TNFR1特異性結(jié)合,但親和力適中的淋巴毒素衍生物L(fēng)Tα-55。初步的藥效學(xué)結(jié)果顯示:LTα-55在獼猴上能夠使血小板和淋巴細(xì)胞上升,對(duì)抗化療藥物的骨髓損傷作用,在小鼠上能夠?qū)购溯椛涔撬钃p傷使生存率顯著增加。由于環(huán)境污染、能源緊缺,核能作為一種高效清潔的能源,在全球被廣泛運(yùn)用。但是,核泄露導(dǎo)致的安全隱患卻對(duì)人類的生存產(chǎn)生巨大的影響。輻射后病人死亡的主要原因是由于骨髓抑制導(dǎo)致的造血功能障礙以及外周血白細(xì)胞下降,繼而使免疫功能損傷,導(dǎo)致繼發(fā)性感染。因此,保護(hù)和恢復(fù)骨髓功能是關(guān)系到輻射損傷患者預(yù)后的關(guān)鍵因素之一,但目前對(duì)核輻射導(dǎo)致的骨髓損傷尚缺乏有效的防護(hù)手段和治療方法。已有的研究表明輻射導(dǎo)致的損傷主要是輻射使骨髓造血細(xì)胞,表皮細(xì)胞和粘膜上皮細(xì)胞等分裂旺盛的細(xì)胞死亡,但最近的研究認(rèn)為輻射也會(huì)導(dǎo)致外周成熟的免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等)顯著減少以及促炎因子大量釋放,從而造成損傷細(xì)胞修復(fù)功能受損,免疫功能抑制。其中,巨噬細(xì)胞在機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫中起著關(guān)鍵作用,其可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,分泌生長因子和吞噬細(xì)胞碎片等方式促進(jìn)炎癥消退和損傷組織的修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中響應(yīng)輻射損傷最早的細(xì)胞類型。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)LTα-55能夠使輻射后小鼠的生存率顯著上升,骨髓造血功能提前恢復(fù),并且在進(jìn)一步體外研究中發(fā)現(xiàn),LTα-55能促進(jìn)人單核細(xì)胞株thp-1分泌il-1β增多。il-1β的分泌增多和NLRP3炎癥小體的激活有關(guān)。我們進(jìn)一步采用NLRP3炎癥小體相關(guān)基因敲除小鼠(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))和人單核細(xì)胞株thp-1探討了NLRP3炎癥小體在LTα-55對(duì)核輻射小鼠骨髓損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。二、研究方法體內(nèi)試驗(yàn)觀察了LTα-55對(duì)野生型、Nlpr~(3)~(~(-/-))、Asc~(~(-/-))和caspase-1~(-/-)小鼠核輻射骨髓損傷的保護(hù)作用。輻射前兩天和輻射當(dāng)天小鼠尾靜脈各注射一次250μg/kgLTα-55,9.5gy劑量輻照5分鐘后觀察小鼠存活情況;9.0gy劑量輻照不同時(shí)間后進(jìn)行血象、骨髓和相關(guān)病理(主要臟器)檢查。體外實(shí)驗(yàn):在人單核細(xì)胞株thp-1細(xì)胞中觀察LTα-55對(duì)核輻射后細(xì)胞的增殖、凋亡、焦亡和ros生成的影響。細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變、檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡以及ros的生成。電鏡下觀察thp-1細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活,reaLTime-pcr檢測(cè)mrna的表達(dá),westernblot檢測(cè)蛋白的表達(dá),免疫熒光法檢測(cè)骨髓和脾臟組織中的相關(guān)信號(hào)通路分子的定位和表達(dá)。三、研究結(jié)果(一)LTα-55在在體內(nèi)能促進(jìn)野生型C57BL/6小鼠核輻射導(dǎo)致的損傷的恢復(fù)1、LTα-55能促進(jìn)野生型C57BL/6小鼠在9.5gy核輻射后生存率的增加,對(duì)照組小鼠從d8天開始出現(xiàn)死亡,死亡集中發(fā)生在d8~d9天,至d12天對(duì)照組小鼠全部死亡。LTα-55組小鼠,雌性小鼠在d14死亡兩只,雄性小鼠d18死亡一只,其余小鼠均存活至觀察期結(jié)束(d28天)。對(duì)體重的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),雄性小鼠在第10天時(shí)對(duì)照組體重明顯低于LTα-55組。2、LTα-55對(duì)野生型C57BL/6小鼠核輻射后血象的恢復(fù)有促進(jìn)作用,結(jié)果顯示LTα-55對(duì)輻射小鼠的紅系、白系以及血小板的恢復(fù)都有促進(jìn)作用。3、骨髓涂片結(jié)果顯示LTα-55作用下,9.0gy輻射后的野生型小鼠從第七天開始恢復(fù)至第十八天基本恢復(fù)正常。而對(duì)照組第十八天仍顯示骨髓有核細(xì)胞細(xì)胞增生低下。骨髓病理顯示出同樣的結(jié)果。4、脾臟病理顯示LTα-55對(duì)野生型C57BL/6小鼠核輻射后脾臟的髓外造血有促進(jìn)作用。相對(duì)于溶媒對(duì)照組,LTα-55在輻射后第七天脾臟出現(xiàn)淋巴樣增生,第十天出現(xiàn)明顯的髓外造血。(二)LTα-55體體外對(duì)核輻射導(dǎo)致人單核細(xì)胞thp-1損損傷的保護(hù)作作用1、LTα-55能促進(jìn)thp-1細(xì)胞的增殖并促進(jìn)輻照下thp-1細(xì)胞的存活,在50μg/mlLTα-55的作用下能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。2、6Gy~(60)Co-γ輻照后thp-1細(xì)胞發(fā)生g2期阻滯,50μg/mlLTα-55可以幫助細(xì)胞在48小時(shí)時(shí)完全逆轉(zhuǎn)g2期阻滯,恢復(fù)正常細(xì)胞周期。3、10Gy~(60)Co-γ輻照后thp-1細(xì)胞凋亡不明顯,50μg/mlLTα-55處理細(xì)胞48小時(shí)后和對(duì)照組相比凋亡率有所降低。4、10Gy~(60)Co-γ的輻照后,隨著輻射時(shí)間的增加,ros逐漸增加,50μg/ml的LTα-55處理細(xì)胞可以降低10Gy~(60)Co-γ的輻照后72h細(xì)胞內(nèi)ros的含量。5、LTα-55能降低輻射后細(xì)胞的焦亡比率,LTα-55對(duì)輻射后的細(xì)胞有保護(hù)作用。(三)LTα-55的保護(hù)作用和NLRP3炎炎癥小體相關(guān)1、LTα-55對(duì)thp-1細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的影響(1)LTα-55能夠增加thp-1細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、il-1βmrna的表達(dá),高濃度的LTα-55作用24小時(shí),il-18mrna水平也升高,同時(shí)也能促進(jìn)thp-1細(xì)胞分泌il-1β。(2)電鏡結(jié)果顯示輻射后LTα-55能夠迅速激活thp-1細(xì)胞中NLRP3炎癥小體,同時(shí)細(xì)胞輻射后細(xì)胞的損傷程度明顯輕于溶媒對(duì)照組。2、LTα-55對(duì)C57BL/6小鼠核輻射損傷的保護(hù)作用和NLRP3炎癥小體(NLRP3、asc、caspase-1)相關(guān)(1)LTα-55對(duì)NLRP3炎癥小體相關(guān)的基因敲除(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))C57BL/6小鼠核輻射后一般情況和生存率的保護(hù)作用不明顯,和野生型小鼠相比,基因敲除小鼠生存率顯著降低。(2)LTα-55對(duì)NLRP3炎癥小體相關(guān)的基因敲除(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))C57BL/6小鼠核輻射血象的恢復(fù)有一定的促進(jìn)作用,但該促進(jìn)作用要明顯弱于野生型小鼠。(3)骨髓涂片結(jié)果顯示LTα-55作用下,9.0gy輻射后的基因敲除小鼠從第14天才開始有恢復(fù)的趨勢(shì)。而對(duì)照組在觀察終點(diǎn)都未見恢復(fù)。骨髓病理顯示出同樣的結(jié)果。骨髓結(jié)果顯示,LTα-55對(duì)NLRP3炎癥小體相關(guān)的基因敲除(NLRP3~(-/-)、Asc~(~(-/-))、caspase-1~(-/-))C57BL/6小鼠的保護(hù)作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于野生型小鼠。(4)脾臟病理顯示LTα-55對(duì)基因敲除小鼠核輻射后脾臟的髓外造血有一定的促進(jìn)作用。LTα-55組小鼠在輻射后第14天出現(xiàn)明顯的髓外造血,時(shí)間要遲于野生小鼠,LTα-55對(duì)小鼠的保護(hù)作用野生型要強(qiáng)于基因敲除小鼠。(四)LTα-55能能在體內(nèi)激活nf-κb和NLRP3炎炎癥小體1、與對(duì)照相比,野生C57BL/6小鼠胸骨免疫熒光結(jié)果顯示LTα-55激活了nf-κb的p52亞基,同時(shí)使NLRP3的表達(dá)明顯增高。在野生型小鼠脾臟組織的免疫熒光檢測(cè)也證實(shí)LTα-55能上調(diào)il-1β表達(dá),該結(jié)果與細(xì)胞水平的研究結(jié)論一致。2、用westernblot檢測(cè)核輻射和/或LTα-55處理后野生型小鼠和NLRP3~(-/-)小鼠脾臟中NLRP3炎癥小體效應(yīng)因子的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠中,LTα-55能增加輻射小鼠脾臟中il-1β和il-18的蛋白表達(dá),LTα-55組小鼠在輻射1天和3天后il-1β和il-18分別開始升高,3~5天為高峰,7天仍然明顯高于對(duì)照,而在NLRP3~(-/-)小鼠脾臟中il-1β和il-18表達(dá)水平均很低。(五)LTα-55在在核輻射小鼠脾臟中通過上調(diào)BCL-XL抑抑制細(xì)胞凋亡亡,促進(jìn)血小板的生成,從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用用westernblot檢測(cè)核輻射和/或LTα-55處理后小鼠脾臟BCL-XL的蛋白表達(dá),LTα-55能在第七天開始明顯增加核輻射小鼠脾臟中BCL-XL的表達(dá),維持至18天,在NLRP3~(-/-)小鼠中BCL-XL的表達(dá)也有升高,但是沒有野生型小鼠明顯,該結(jié)果也和血象監(jiān)測(cè)中的血小板監(jiān)測(cè)結(jié)果一致。四、結(jié)論LTα-55對(duì)核輻射導(dǎo)致的損傷有顯著的保護(hù)作用,該作用與LTα-55激活NLRP3炎癥小體,進(jìn)而減少ROS的釋放,抑制細(xì)胞凋亡和焦亡有關(guān)。LTα-55在體外還能拮抗核輻射的細(xì)胞周期阻滯作用,促進(jìn)細(xì)胞增殖。LTα-55激活NF-κB(p52)可能參與了NLRP3炎癥小體的激活。LTα-55還能上調(diào)Bcl-XL的表達(dá),這除了與LTα-55保護(hù)輻射所致的細(xì)胞凋亡和焦亡有關(guān)外,可能還與血小板的再生,進(jìn)而機(jī)體重新啟動(dòng)免疫有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R818

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本文編號(hào)：1691421