本文關(guān)鍵詞： 中低頻 純音 強(qiáng)聲 海馬　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景高聲壓級(jí)的可聽(tīng)聲首先直接作用于聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng),然后通過(guò)聽(tīng)覺(jué)器官再作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),而且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),會(huì)引起一系列繼發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。對(duì)于強(qiáng)聲暴露引起的神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂和損傷,目前的研究結(jié)論多建立在強(qiáng)噪聲暴露的臨床經(jīng)歷和嚙齒類動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上。而對(duì)于純音強(qiáng)聲、尤其是中低頻純音強(qiáng)聲的生物效應(yīng)尚研究較少。就強(qiáng)聲暴露對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)理而言,目前的研究主要集中在腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)和相關(guān)受體的合成、釋放和轉(zhuǎn)運(yùn)等方面。對(duì)于影響腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)和相關(guān)受體的機(jī)制研究較少,參與介導(dǎo)的信號(hào)通路尚未明確闡明。海馬和皮層的神經(jīng)元突觸,如果長(zhǎng)時(shí)間維持增強(qiáng)的誘導(dǎo)、可導(dǎo)致突觸敏感化,引起神經(jīng)遞質(zhì)含量減少,從而影響正常的神經(jīng)系統(tǒng)的功能。其最為突出的表現(xiàn)是空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力下降,但是目前強(qiáng)聲暴露對(duì)海馬和皮層神經(jīng)元遞質(zhì)及受體的作用機(jī)制尚不清楚。因此,本課題以巴馬小型豬為研究對(duì)象,系統(tǒng)的觀察了中低頻純音強(qiáng)聲暴露對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的特點(diǎn),并初步探討了強(qiáng)聲可能致海馬和皮層神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制,為進(jìn)一步闡述強(qiáng)聲致神經(jīng)損傷的相關(guān)機(jī)理提供了參考。材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以巴馬小型豬作為研究對(duì)象。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)條件相同。30只巴馬小型豬隨機(jī)分為3組:空白對(duì)照組,900 Hz-130 dB強(qiáng)聲暴露組和900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露組。空白對(duì)照組小型豬不進(jìn)入強(qiáng)聲實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng);130 dB強(qiáng)聲暴露組采用900 Hz、130 dB強(qiáng)聲刺激15 min;142 dB組采用900 Hz、142 dB強(qiáng)聲刺激15 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)抽取小型豬5只,麻醉后抽取靜脈血10 ml,獲取血液后將其處死,取出相同部位的部分海馬和皮層組織,分別存放于液氮和4%的福爾馬林溶液中。每組剩余的小型豬送回實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心留觀,一周后同法取樣。1、血清生化分析:獲得的靜脈血凝血后2000 rpm室溫離心10 min,取上層血清,使用全自動(dòng)血液分析儀對(duì)小型豬各血清樣品生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)內(nèi)容包括血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、a-羥丁酸脫氫酶(a-HBDH)、總膽汁酸(TBA)、超氧化物歧化酶(SOD)、g-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)、堿性磷酸酶(ALP)、亮氨酸氨肽酶(LAP)等。2、血清神經(jīng)內(nèi)分泌激素分析:獲得的血清,按照相應(yīng)激素的檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書提供的實(shí)驗(yàn)步驟,采用ELISA方法對(duì)血清中不同激素的含量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)的激素包括促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、血清皮質(zhì)醇(CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、去甲腎上腺素(NE)、腦紅蛋白(NGB)、神經(jīng)肽P(NPP)、神經(jīng)肽Y(NPY)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、血清S100-b等。3、腦組織形態(tài)學(xué)觀察:將固定后的組織樣品依次進(jìn)行梯度脫水、石蠟包埋后進(jìn)行石蠟切片,切片厚度4μm,切片后進(jìn)行HE染色,封片后于顯微鏡下觀察并拍照。4、鈣離子濃度分析:OTC包埋組織,冰凍切片機(jī)切片,加入Fluo-4進(jìn)行染色、孵育并清洗后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察鈣離子的熒光信號(hào),使用ZEN2011軟件對(duì)鈣離子濃度進(jìn)行定量分析。5、基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè):液氮中冷凍組織經(jīng)研磨后使用Qiagen試劑盒提取總的mRNA,總RNA定量后,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;針對(duì)PKC、PI3K和CACNA2D1基因,選用合適的引物,采用Real-time PCR方法定量分析上述基因表達(dá)水平。6、PKC和Ca2+受體蛋白表達(dá)水平檢測(cè):將液氮中凍存冷凍的組織充分裂解后,提取組織蛋白,然后進(jìn)行蛋白電泳和蛋白轉(zhuǎn)印。PKC和Ca2+受體特異的抗體4℃孵育過(guò)夜,洗膜后,二抗室溫孵育60 min,最后進(jìn)行暗室顯影,對(duì)PKC和Ca2+受體蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果巴馬小型豬分別暴露在900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB的中低頻純音強(qiáng)聲條件下15分鐘后均出現(xiàn)明顯的行為異常,表現(xiàn)為:小型豬大部分采取背對(duì)強(qiáng)聲發(fā)生裝置的姿勢(shì),出現(xiàn)興奮性增強(qiáng),局促不安,撞籠等現(xiàn)象,個(gè)別小豬出現(xiàn)了小便失禁,無(wú)法自主站立或前肢跪下等行為異常反應(yīng),對(duì)銳器刺激反應(yīng)不敏感。以上異常行為提示有神經(jīng)系統(tǒng)損傷。900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB強(qiáng)聲暴露15分鐘后和暴露后一周血清指標(biāo)顯示:(1)血清中SOD的含量都明顯增加;血清中CK含量都明顯下降;(2)血清中CRP含量都明顯上升,而血清中NE和LDH、CK-MB、ALP、a-HBDH含量都明顯下降;(3)900 Hz-130 dB強(qiáng)聲暴露15分鐘后血清中CORT和α-HBDH含量下降;900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露15分鐘后血清中NSE含量升高,血清中(γ-GT)含量下降;(4)900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露一周后血清中NPY和TBA含量上升;此外,短時(shí)間的強(qiáng)聲暴露對(duì)血清中ACTH、CRH、NGB、NPP、S100-β、LAP的含量沒(méi)有明顯的影響。以上結(jié)果提示SOD、NSE和CK有可能作為強(qiáng)聲對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的標(biāo)志物。小型豬腦組織形態(tài)學(xué)分析:海馬組織HE染色顯示:900 Hz-130 dB強(qiáng)聲暴露組未見(jiàn)明顯損傷樣改變,900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露組可見(jiàn)海馬組織出現(xiàn)明顯的損傷樣改變,部分顆粒細(xì)胞核明顯固縮,細(xì)胞質(zhì)空泡化,椎體細(xì)胞水腫較為明顯,提示這部分細(xì)胞可能已經(jīng)凋亡。小型豬腦組織中鈣離子濃度的定量分析顯示:與空白對(duì)照組相比,900Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露組可見(jiàn)海馬組織中鈣離子濃度明顯增加,而在皮層組織中,鈣離子濃度明顯下降。小型豬腦組織中PKC、PI3K和CACNA2D1基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè):與空白對(duì)照組相比,900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露組海馬組織中PKC、PI3K和CACNA2D1的mRNA出現(xiàn)明顯上調(diào);而在皮層組織中,強(qiáng)聲暴露后PKC、PI3K和CACNA2D1的mRNA出現(xiàn)明顯下調(diào)。小型豬腦組織中PKC和Ca2+受體蛋白表達(dá)水平檢測(cè):與空白對(duì)照組相比,900 Hz-142 dB強(qiáng)聲暴露組的海馬組織中,PKC和鈣離子受體的表達(dá)明顯增加;而在皮層組織中,PKC和鈣離子受體的表達(dá)明顯下降。結(jié)論綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB的中低頻純音強(qiáng)聲暴露15分鐘后,小型豬出現(xiàn)異常行為反應(yīng)。900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB強(qiáng)聲暴露組可見(jiàn)血清中部分生化分子和神經(jīng)內(nèi)分泌激素發(fā)生不同程度的變化,其中NSE和SOD明顯升高、CK含量明顯下降,提示SOD、NSE和CK有可能作為強(qiáng)聲對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的標(biāo)志物。900 Hz-142 dB短時(shí)間的強(qiáng)聲刺激可引起大腦海馬組織損傷樣改變,而皮層組織結(jié)構(gòu)影響未見(jiàn)明顯異常。15分鐘900 Hz-142 dB中低頻純音強(qiáng)聲刺激作用于海馬組織,通過(guò)激活PI3K、PKC信號(hào)通路,引起CACNA2D1的表達(dá)上調(diào),引起海馬組織細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量增加;而在皮層組織中,強(qiáng)聲刺激則抑制PI3K、PKC信號(hào)通路,下調(diào)CACNA2D1的表達(dá),從而使皮層組織細(xì)胞中鈣離子含量減少。以上結(jié)果不僅揭示了強(qiáng)聲引起神經(jīng)損傷的可能機(jī)制,同時(shí)也為防治強(qiáng)聲對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成的損傷提供了新的思路。
[Abstract]:A series of experimental animals were randomly divided into 3 groups : blank control group , 900 Hz - 130 dB intensity exposure group and 900 Hz - 142 dB strong acoustic exposure group . The contents of different hormones in serum were determined by ELISA . The levels of mRNA and total RNA were analyzed by using the method of ELISA . The levels of mRNA and total RNA were analyzed by using the method of ELISA . The results suggested that SOD , NSE and CK could be used as markers for the damage to nervous system after 15 minutes exposure to 900 Hz - 142 dB and 900 Hz - 130 dB . In comparison with the control group , the levels of PKC , PIKs and CACNA2D1 mRNA in the hippocampus were significantly decreased . The levels of PKC , PI3 and CACNA2D1 in the hippocampus were significantly decreased compared with the control group . The expression of CACNA2D1 is downregulated , so that the content of calcium ions in the cortical tissue cells is reduced . The above results not only reveal the possible mechanism of the strong sound to cause nerve injury , but also provide a new idea for the prevention and treatment of the damage caused by the strong sound to the nervous system .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R82

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1512550