本文關(guān)鍵詞：線粒體介導(dǎo)砷致人支氣管上皮細(xì)胞（HBE）氧化損傷的研究

  更多相關(guān)文章： 亞砷酸鈉 人支氣管上皮細(xì)胞 線粒體DNA 氧化損傷 細(xì)胞凋亡

【摘要】：目的探討線粒體DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)在亞砷酸鈉(Sodium arsenite,NaAsO2)染毒致人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells,HBE)氧化損傷中的作用,為闡明砷毒性作用的分子機(jī)制提供新的研究途徑。方法1.線粒體DNA拷貝數(shù)降低HBE細(xì)胞模型的建立:結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料,用含微量溴化乙錠(ethidium bromide,EtBr)的培養(yǎng)基持續(xù)誘導(dǎo),從而構(gòu)建mt DNA拷貝數(shù)降低的HBE細(xì)胞株。通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷、real-time PCR鑒定HBE細(xì)胞內(nèi)mt DNA缺失情況,將mt DNA拷貝數(shù)降低的HBE細(xì)胞定義為ρ-HBE,而將未經(jīng)EtBr處理的對(duì)照組HBE細(xì)胞定義為ρ+HBE。根據(jù)方法2中得出的染毒劑量,用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白NQO1的水平,驗(yàn)證mt DNA缺失細(xì)胞增殖情況。2.染毒劑量確定:以ρ+HBE和ρ-HBE兩組細(xì)胞為研究對(duì)象,用不同濃度(0~160μM)的亞砷酸鈉進(jìn)行細(xì)胞染毒,采用MTT細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HBE細(xì)胞存活率。通過(guò)SPSS19.0軟件計(jì)算得出兩組細(xì)胞的IC50和細(xì)胞存活率在70%以上的NaAsO2濃度,確定后續(xù)NaAsO2染毒劑量。3.氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè):用不同濃度NaAsO2(0、1、2、4、8、16μM)染毒處理ρ+HBE和ρ-HBE細(xì)胞24h,收集細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,用硫代巴比妥酸(TBA)比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,用WST-1法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力,用DTNB速率比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,用Western blot方法檢測(cè)Keap1/Nrf2-ARE抗氧化信號(hào)通路相關(guān)蛋白Nrf2、Keap1及下游血紅素單加氧酶(heme oxygenase 1,HO-1)表達(dá)情況。4.細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè):實(shí)驗(yàn)染毒方案同方法3,通過(guò)Western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白水平及變化情況。結(jié)果1.線粒體dna拷貝數(shù)降低hbe細(xì)胞模型的建立:hbe細(xì)胞在含有50ng/mletbr的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)7d后,在ρ0(mtdna完全缺失細(xì)胞)篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d,細(xì)胞腫脹,結(jié)構(gòu)模糊不清,且出現(xiàn)大量漂浮及死亡現(xiàn)象;real-timepcr結(jié)果顯示,etbr誘導(dǎo)培養(yǎng)的hbe細(xì)胞mtdna拷貝數(shù)降低了97.30%;用不同濃度naaso2(0、1、2、4、8、16μm)處理兩組細(xì)胞24h后,對(duì)照組ρ+hbe細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白nqo1水平呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),ρ-hbe細(xì)胞內(nèi)nqo1蛋白水平呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),且均低于ρ+hbe細(xì)胞(p0.05)。2.不同劑量亞砷酸鈉作用對(duì)兩組hbe細(xì)胞存活率的影響:不同濃度(0~160μm)的naaso2作用于兩組細(xì)胞24h,mtt細(xì)胞毒性結(jié)果顯示,隨著naaso2染毒濃度的增加,兩組細(xì)胞存活率均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),且在相同濃度naaso2作用下,ρ-hbe細(xì)胞相對(duì)存活率均高于ρ+hbe細(xì)胞,利用spss19.0計(jì)算得出亞砷酸鈉染毒ρ-hbe細(xì)胞ic50為88.35μm,ρ+hbe細(xì)胞為75.34μm,同時(shí)細(xì)胞增殖率在70%以上的naaso2濃度分別為≤26.83μm(ρ-hbe)、≤14.66μm(ρ+hbe),由此確定naaso2的后續(xù)染毒劑量為0、1、2、4、8、16μmol/l。3.不同劑量亞砷酸鈉作用對(duì)兩組hbe細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響:隨著naaso2染毒濃度的增加,ρ+hbe細(xì)胞內(nèi)ros和mda水平呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),而ρ-hbe細(xì)胞則呈現(xiàn)出不升反降的趨勢(shì),且均高于ρ+hbe細(xì)胞(p0.05);隨著naaso2染毒濃度的增加,兩組細(xì)胞內(nèi)sod酶活力水平逐漸降低,在小于8μmnaaso2作用下,ρ-hbe細(xì)胞內(nèi)sod酶活力水平高于ρ+hbe細(xì)胞(p0.05),而在16μmnaaso2作用下,ρ-hbe細(xì)胞內(nèi)sod酶活力水平則低于ρ+hbe細(xì)胞(p0.05);兩組細(xì)胞內(nèi)gsh、gsh/gssg水平隨著naaso2濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),且ρ-hbe細(xì)胞內(nèi)gsh水平在0~4μmnaaso2染毒時(shí)高于ρ+hbe細(xì)胞,而在8~16μmnaaso2染毒時(shí)則低于ρ+hbe細(xì)胞(p0.05),ρ-hbe細(xì)胞內(nèi)gsh/gssg比值水平均明顯低于ρ+hbe細(xì)胞(p0.05);隨著naaso2濃度的不斷增加,兩組細(xì)胞內(nèi)nrf2和keap1蛋白水平呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),ρ-hbe細(xì)胞內(nèi)nrf2和keap1水平相較于ρ+hbe細(xì)胞呈現(xiàn)持續(xù)高水平狀態(tài),且均高于ρ+hbe細(xì)胞(p0.05);兩組細(xì)胞內(nèi)ho-1蛋白水平隨著naaso2染毒濃度的增加而增加,且ρ-hbe細(xì)胞內(nèi)ho-1水平要高于ρ+hbe細(xì)胞(p0.05)。4.不同劑量亞砷酸鈉作用對(duì)兩組HBE細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白水平的影響:隨著NaAsO2染毒濃度的增加,ρ+HBE細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白水平均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),而ρ-HBE細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白水平則逐漸降低;在0~4μM NaAsO2染毒時(shí),ρ-HBE細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白水平高于ρ+HBE細(xì)胞,而在8~16μM NaAsO2染毒時(shí)則低于ρ+HBE細(xì)胞(P0.05);ρ-HBE細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白水平均低于ρ+HBE細(xì)胞(P0.05);兩組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值則隨著NaAsO2染毒濃度的增加均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),且ρ-HBE細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值均高于ρ+HBE細(xì)胞(P0.05);隨著NaAsO2濃度的增加,兩組細(xì)胞內(nèi)Caspase-9和Cleaved Caspase-9蛋白水平均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),且ρ-HBE細(xì)胞內(nèi)Caspase-9和Cleaved Caspase-9蛋白水平均明顯低于ρ+HBE細(xì)胞(P0.05);隨著NaAsO2染毒濃度的增加,兩組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白水平均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),且兩組細(xì)胞內(nèi)蛋白趨勢(shì)相比無(wú)明顯差別。結(jié)論線粒體DNA的存在會(huì)在一定程度上減輕砷所致的氧化損傷,同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以清除受損的細(xì)胞,從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。
【關(guān)鍵詞】：亞砷酸鈉 人支氣管上皮細(xì)胞 線粒體DNA 氧化損傷 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-15
• 第一部分 線粒體DNA拷貝數(shù)降低HBE細(xì)胞模型的建立15-27
• 1 材料與方法15-22
• 1.1 材料15-17
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-22
• 2 結(jié)果22-25
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及營(yíng)養(yǎng)缺陷鑒定22-23
• 2.2 ρ-HBE細(xì)胞mt DNA拷貝數(shù)的變化23-24
• 2.3 不同劑量亞砷酸鈉染毒對(duì)HBE細(xì)胞增殖蛋白NQO1的影響24-25
• 3 討論25-27
• 第二部分 線粒體DNA在不同劑量亞砷酸鈉染毒對(duì)HBE細(xì)胞存活率影響中的作用27-33
• 1 材料與方法27-29
• 1.1 材料27-28
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法28-29
• 2 結(jié)果29-31
• 2.1 不同劑量亞砷酸鈉染毒對(duì)HBE細(xì)胞存活率的影響29-30
• 2.2 根據(jù)SPSS19.0 計(jì)算確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)亞砷酸鈉的染毒劑量30-31
• 3 討論31-33
• 第三部分 線粒體DNA在亞砷酸鈉誘導(dǎo)HBE細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用33-45
• 1 材料與方法33-38
• 1.1 材料33-35
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法35-38
• 2 結(jié)果38-41
• 2.1 不同濃度亞砷酸鈉誘導(dǎo)兩組HBE細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平的變化38-39
• 2.2 不同濃度亞砷酸鈉誘導(dǎo)兩組HBE細(xì)胞內(nèi)SOD活力水平的變化39
• 2.3 不同濃度亞砷酸鈉誘導(dǎo)兩組HBE細(xì)胞內(nèi)GSH水平的變化39-40
• 2.4 不同濃度亞砷酸鈉誘導(dǎo)兩組HBE細(xì)胞Keap1/Nrf2-ARE抗氧化通路水平的變化40-41
• 3 討論41-45
• 第四部分 線粒體DNA在亞砷酸鈉誘導(dǎo)HBE細(xì)胞凋亡中的作用45-53
• 1 材料與方法45-47
• 1.1 材料45-46
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法46-47
• 2 結(jié)果47-50
• 2.1 不同濃度亞砷酸鈉誘導(dǎo)兩組HBE細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白水平的變化47-48
• 2.2 不同濃度亞砷酸鈉誘導(dǎo)兩組HBE細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值的變化48
• 2.3 不同濃度亞砷酸鈉誘導(dǎo)兩組HBE細(xì)胞內(nèi)Caspase-9 比值的變化48-49
• 2.4 不同濃度亞砷酸鈉誘導(dǎo)兩組HBE細(xì)胞內(nèi)Caspase-3 比值的變化49-50
• 3 討論50-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 綜述 線粒體、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡62-70
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 中英文縮略語(yǔ)對(duì)照表70-71
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章及科研經(jīng)歷71-73
• 致謝73-75

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