本文關鍵詞：DEB通過氧化應激誘導雄性生殖細胞DNA損傷和周阻滯的研究

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【摘要】：目的1,3-丁二烯(1,3-Butadiene,BD)被廣泛應用于合成尼龍、塑料、橡膠等產品,其作為一種重要的化工原料不僅引起職業(yè)人群的健康損害,同時因其在汽車尾氣、香煙煙霧及食用油煙中普遍存在被認定居民住宅環(huán)境區(qū)的主要污染物之一。國際癌癥研究組織(IARC)也于2008年認定BD為一級致癌物。它的活性中間代謝產物1,2,3,4-二環(huán)氧丁烷(1,2,3,4-diepoxybutane,DEB)具有較強的基因毒性,可以導致遺傳物質發(fā)生損傷。但其對雄性生殖細胞的損傷與周期阻滯之間的關系及相關機制有待進一步闡明。方法給予100,300,500μM DEB處理GC-2細胞(小鼠精母細胞),采用cck-8和Ed U實驗檢測細胞增殖情況。運用流式細胞儀檢測GC-2細胞內活性氧(ROS)含量以及DEB對GC-2細胞周期和凋亡的影響。通過吉姆薩染色法檢測GC-2細胞有絲分裂指數。運用堿性彗星實驗、胞質阻滯分裂微核實驗、western blot方法分析DEB處理后GC-2細胞的損傷情況。應用western blot檢測細胞周期信號通路Chk1/Cdc25c/Cdc2/Cyclin B1蛋白表達及其磷酸化的變化情況。運用免疫熒光法檢測Cyclin B1在GC-2細胞胞核中的分布。在以上方法的基礎上,提前1h給予10 m M抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理,分析DEB處理后NAC對GC-2細胞ROS含量、g-H2AX蛋白的表達、G2/M周期分布及細胞周期關鍵調控分子p-Chk1、p-Cdc25c蛋白的影響。提前4h給予Chk1蛋白激酶抑制劑UCN-01處理,觀察DEB處理后UCN-01對GC-2細胞周期分布及周期關鍵調控分子p-Chk1、p-Cdc25c、p-Cdc2的表達情況。為了進一步驗證Chk1的重要性,給予Chk1 si RNA檢測G2期關鍵調控蛋白分子磷酸化蛋白的表達情況。同時,我們在小鼠動物體內驗證了DEB對生殖細胞周期的影響。選取24只健康成年昆明小鼠(10-12周)適應性喂養(yǎng)一周后,隨機分成4組,于第1、3、5天腹腔注射不同劑量的DEB(0、17、34.5、85mg/kg)。在首次染毒后第7天小鼠被處死,采用流式細胞術、組織病理學技術(HE染色)、免疫組織化學法檢測DEB對小鼠睪丸細胞DNA含量分布、小鼠睪丸形態(tài)學的改變及周期蛋白在小鼠睪丸組織中的表達情況,采用計算機精液輔助分析儀(CASA)檢測DEB對小鼠精液參數的改變,通過南京試劑盒檢測小鼠肝臟丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)的含量。結果研究發(fā)現,DEB處理后可抑制GC-2細胞的增殖,進而通過流式細胞術觀察到DEB處理組G2/M期比例顯著高于對照組(p0.05)但無凋亡的發(fā)生,表明DEB可誘導GC-2細胞發(fā)生G2/M期阻滯。流式分析發(fā)現,DEB處理組中DCF平均熒光強度要明顯高于對照組(p0.05),提示DEB可誘導GC-2細胞內ROS含量增加。熒光顯微鏡下觀察DEB處理組GC-2細胞彗星的Tail Length、Tail DNA%、Tail Moment值均明顯高于對照組(p0.05),westen blot結果顯示,與對照組相比,隨著DEB的增加,γ-H2AX蛋白表達水平顯著增加,胞質阻滯分裂微核實驗發(fā)現,微核、核質橋、核芽突率明顯高于對照(p0.05),這些結果提示DEB可以誘導GC-2細胞發(fā)生DNA損傷。同時,吉姆薩染色顯示,DEB處理后有絲分裂指數顯著增加,免疫熒光法顯示Cyclin B1在GC-2細胞核內的表達逐漸減少,western blot結果顯示,DEB處理后可上調ATM/Chk1信號通路P-ATM、P-Chk1、P-Cdc25c、P-Cdc2、Cyclin B1的蛋白表達水平,下調有絲分裂期標志蛋白p-H3的表達,提示DEB處理后可誘導GC-2細胞G2期阻滯。為了探討氧化應激參與了DEB的生物效應,在給予NAC處理后發(fā)現ROS含量明顯下降,γ-H2AX蛋白表達水平被下調,NAC+DEB處理組G2期比例較與DEB處理組顯著降低(p0.05),而且NAC可以部分逆轉DEB對p-Chk1、p-Cdc25c蛋白表達的抑制作用,從而緩解G2期阻滯。為了檢測Chk1在G2期的重要性,給予chk1蛋白酶抑制劑UCN-01處理后發(fā)現UCN-01+DEB處理組G2期比例較DEB處理組顯著降低(p0.05),且UCN-01+DEB處理組較DEB處理組可下調P-Chk1、P-Cdc25c、P-Cdc2蛋白水平。同時chk1 si RNA+DEB處理組較DEB處理組也可下調P-Chk1、P-Cdc25c、P-Cdc2蛋白水平,提示Chk1在G2期發(fā)揮了重要的作用。在DEB腹腔注射小鼠的體內實驗中,小鼠精子畸形率顯著增加,精子活動力減弱,HE染色結果提示,DEB處理組與對照組比較,小鼠睪丸細胞有空泡及固縮的核形成,曲細精管排列紊亂,精子細胞層數減少及空管的形成。流式結果顯示,與對照組相比,各劑量染毒組的四倍體細胞比例顯著提高(p0.05)。免疫組化結果顯示,DEB處理組中小鼠睪丸p-H3蛋白表達平均光密度值逐漸減少,P-Chk1蛋白表達的平均光密度值較對照組明顯升高。小鼠肝臟組織氧化水平MDA顯著增加,抗氧化水平GSH-Px、SOD水平顯著減少。結論DEB可能通過氧化應激誘導生殖細胞損傷,引起生殖細胞阻滯在G2期,同時也為DEB作用于男性生殖系統(tǒng)的相關機制提供了線索
【關鍵詞】：DEB DNA 損傷 G2 期阻滯 生殖毒性 氧化應激
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 英漢縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 DEB通過氧化應激誘導GC-2 細胞周期阻滯的機制研究17-52
• 1 材料與方法17-29
• 2 結果29-49
• 3 討論49-51
• 4 小結51-52
• 第二部分 DEB對小鼠睪丸生殖細胞損傷及周期的影響52-64
• 1 材料與方法52-54
• 2 結果54-61
• 3 討論61-63
• 4 小結63-64
• 全文總結64-65
• 參考文獻65-71
• 附錄71-72
• 致謝72-73
• 綜述73-81
• 參考文獻77-81

【參考文獻】

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1 劉勝學;周燕虹;付婷婷;袁健;曹佳;;1，3-丁二烯生產車間工人職業(yè)接觸監(jiān)測及健康影響調查[J];中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志;2007年05期

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本文編號：864246