本文關(guān)鍵詞：EMA-qPCR檢測公共場所氣溶膠中存活的嗜肺軍團(tuán)菌

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【摘要】：目的建立疊氮溴乙錠(ethidium monoazide bromide, EMA)與熒光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,目結(jié)合檢測公共場所氣溶膠中存活嗜肺軍團(tuán)菌的方法。 方法在實驗室用培養(yǎng)的嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行實驗,得到EMA處理的最適條件,即在不影響活菌PCR信號的前提下,盡可能的抑制死菌的PCR信號；在實驗室采集嗜肺軍團(tuán)菌氣溶膠模擬樣品,設(shè)EMA處理組和對照組,驗證其檢測活菌的效果；最后,將本方法在公共場所進(jìn)行現(xiàn)場應(yīng)用實驗。 結(jié)果EMA終濃度在2.5μg/ml、4-C孵育5min、光照5min的處理,可以在不影響活菌的情況下使死菌qPCR的信號降低2lg copies/ml左右,即可以抑制99%的死菌的PCR擴(kuò)增。雜菌的存在不影響EMA-qPCR對存活嗜肺軍團(tuán)菌的檢出。當(dāng)死菌和活菌的比例不超過1000：1時,EMA-qPCR可以實現(xiàn)對存活嗜肺軍團(tuán)菌的定量檢測。公共場所氣溶膠樣品EMA處理組嗜肺軍團(tuán)菌的陽性率35%(21/60),對照組57.5%(23/40)。在來自同一采樣點的11對配對樣品中,有1對樣品EMA處理結(jié)果與對照組結(jié)果相等,5對樣品的EMA處理組的qPCR結(jié)果低于對照組,qPCR信號平均降低0.58lg copies/ml,其余樣品EMA處理組結(jié)果略高。 結(jié)論EMA-qPCR可以用于公共場所氣溶膠中存活嗜肺軍團(tuán)菌的快速定量檢測,檢測結(jié)果不受死亡的嗜肺軍團(tuán)菌、雜菌和氣溶膠樣品中其他成分的影響。
【關(guān)鍵詞】：疊氮溴乙錠 熒光定量PCR 嗜肺軍團(tuán)菌 公共場所 氣溶膠
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R126.4
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-13
• 縮略語表13-15
• 第一章 引言15-39
• 1.1 軍團(tuán)菌15-19
• 1.1.1 軍團(tuán)菌病的散發(fā)、暴發(fā)和流行15-17
• 1.1.2 軍團(tuán)菌在環(huán)境中的污染情況17
• 1.1.3 公共場所、集中空調(diào)與軍團(tuán)菌17-18
• 1.1.4 軍團(tuán)菌與氣溶膠18-19
• 1.1.5 小結(jié)19
• 1.2 軍團(tuán)菌的檢測19-21
• 1.2.1 培養(yǎng)法19
• 1.2.2 PCR技術(shù)19-20
• 1.2.3 免疫學(xué)方法20-21
• 1.2.4 小結(jié)21
• 1.3 微生物活性方法概述21-29
• 1.3.1 DVC法21-22
• 1.3.2 基于RNA的PCR技術(shù)22-23
• 1.3.3 NASBA技術(shù)23-24
• 1.3.4 熒光原位雜交24
• 1.3.5 LIVE/DEAD BacLightTM Bacterial Viability Kit24-25
• 1.3.6 CTC/INT25-26
• 1.3.7 ChemChrome V626-27
• 1.3.8 5(6)cFDA27
• 1.3.9 MTT比色法27-28
• 1.3.10 ATP生物發(fā)光法28
• 1.3.11 小結(jié)28-29
• 1.4 EMA和PMA國內(nèi)外研究現(xiàn)況29-35
• 1.4.1 EMA/PMA作用原理29-32
• 1.4.2 EMA/PMA方法的應(yīng)用32-33
• 1.4.3 EMA/PMA作用效果的影響因素33-34
• 1.4.4 小結(jié)34-35
• 1.5 EMA/PMA-軍團(tuán)菌35-39
• 1.5.1 文獻(xiàn)總結(jié)35-37
• 1.5.2 EMA/PMA的選擇37
• 1.5.3 EMA溶劑的選擇37-38
• 1.5.4 孵育溫度的選擇38
• 1.5.5 在環(huán)境樣品中的應(yīng)用38-39
• 第二章 研究目的和技術(shù)路線39-40
• 2.1 研究目的39
• 2.2 技術(shù)路線39-40
• 第三章 實驗材料、試劑和儀器40-42
• 3.1 菌株40
• 3.2 耗材40
• 3.3 儀器40
• 3.4 普通PCR的引物40-41
• 3.5 熒光定量PCR的探針、引物和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品41-42
• 第四章 實驗方法42-47
• 4.1 菌液制備與基本實驗流程42-44
• 4.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)和菌液制備42
• 4.1.2 EMA工作液的制備42
• 4.1.3 EMA處理42-43
• 4.1.4 DNA提取43
• 4.1.5 普通PCR和電泳43
• 4.1.6 熒光定量PCR43-44
• 4.2 EMA處理條件的優(yōu)化44
• 4.2.1 EMA光照時間的優(yōu)化44
• 4.2.2 EMA孵育時間的優(yōu)化44
• 4.2.3 EMA濃度的優(yōu)化44
• 4.3 雜菌的影響44-45
• 4.4 氣溶膠模擬樣品45-46
• 4.4.1 氣溶膠吸收液的配制45
• 4.4.2 切割型濃縮器+Biosampler聯(lián)合采樣法45
• 4.4.3 氣溶膠模擬樣品的制備45-46
• 4.4.4 氣溶膠模擬樣品的處理46
• 4.5 EMA-qPCR方法的現(xiàn)場驗證46-47
• 4.5.1 場所選擇、現(xiàn)場采樣點分布和氣溶膠樣品采集46
• 4.5.2 現(xiàn)場樣品預(yù)處理46-47
• 第五章 實驗結(jié)果47-61
• 5.1 細(xì)菌的培養(yǎng)計數(shù)和熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線47-50
• 5.1.1 細(xì)菌的培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果47
• 5.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、靈敏度、特異度47-50
• 5.2 EMA處理條件的優(yōu)化50-53
• 5.2.1 孵育時間的優(yōu)化50-51
• 5.2.2 光照時間的優(yōu)化51-52
• 5.2.3 EMA濃度的優(yōu)化52-53
• 5.3 雜菌的影響53-56
• 5.4 氣溶膠模擬樣品56-57
• 5.5 公共場所氣溶膠樣品檢測結(jié)果57-61
• 第六章 結(jié)果討論61-65
• 6.1 方法的選擇61
• 6.2 EMA處理條件61-62
• 6.3 雜菌的影響62
• 6.4 氣溶膠模擬樣品的結(jié)果62-63
• 6.5 EMA-qPCR與其它活性檢測方法的比較63
• 6.6 氣溶膠樣品采樣方式63-64
• 6.7 氣溶膠樣品檢測64-65
• 第七章 結(jié)論與展望65-67
• 7.1 結(jié)論65
• 7.2 研究的局限性與展望65-67
• 參考文獻(xiàn)67-77
• 附1 DNA提取操作規(guī)程77-79
• 附2 公共場所環(huán)境現(xiàn)況調(diào)查表79-85
• 致謝85-86
• 個人簡歷86-88
• 研究生在讀期間發(fā)表論文88-97

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：855070