發(fā)布時間：2017-08-18 07:31

  本文關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門菌spvB.spvC基因共同缺陷變異株的構(gòu)建及spvB、spvC基因?qū)χ卸景Y狀、免疫功能的影響

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【摘要】：目的:實驗組前期已構(gòu)建鼠傷寒沙門菌spvB/spvC基因缺陷株,故本研究僅構(gòu)建鼠傷寒沙門菌spvB.spvC基因共同缺陷株,并將野生菌株與這三株缺陷變異株感染小鼠,觀察分析spvB/spvC基因?qū)χ卸景Y狀、免疫調(diào)節(jié)功能的影響。為研究鼠傷寒沙門菌spvB/spvC毒力基因的致病機(jī)制提供理論和實驗依據(jù),并為后續(xù)細(xì)胞實驗進(jìn)一步研究該基因的功能及疫苗的制備提供工具和手段。方法:1.同源重組法制備鼠傷寒沙門菌spvB.spvC基因共同缺陷株。在GeneBank數(shù)據(jù)庫中查出鼠傷寒沙門菌毒力基因spv序列(包括spvABCD),給spvB、spvC設(shè)計兩對特異性引物,并在引物的5’末端加上酶切位點(diǎn),PCR法擴(kuò)增spvB基因上游及spvC基因下游的核苷酸片段后,連接至自殺質(zhì)粒pCVD442(pCVD442-ΔspvB.spvC)。再將pCVD442-ΔspvB.spvC入感受態(tài)細(xì)菌SM10λpir內(nèi),按接合轉(zhuǎn)移法使pCVD442-ΔspvB.spvC導(dǎo)入野生型鼠傷寒沙門菌211(spvB+.spvC+)中,隨后蔗糖誘導(dǎo)同源重組。用PCR擴(kuò)增來觀察重組情況,將穩(wěn)定的完全重組株認(rèn)為是spvB.spvC基因共同缺陷變異株,并送基因測序鑒定。2.沙門菌spvB/spvC基因?qū)χ卸景Y狀、免疫調(diào)節(jié)功能影響的研究。所有BALB/c小鼠均給予自由進(jìn)食、飲水,室溫(20℃-22℃),濕度(50%-55%)飼養(yǎng)。隨機(jī)分為PBS組、野生型沙門菌211(Samonella typhimurium,STM.211)組、敲除spvB基因的沙門菌(STM.211-ΔspvB)組、敲除spvC基因的沙門菌(STM.211-Δspv C)組和同時敲除spv B.spvC基因的沙門菌(STM.211-ΔspvB.spvC)組,每組25只。PBS組經(jīng)腹腔注射(intraperitoneal,i.p.)0.2ml PBS,其余各組分別注射0.2ml 105CFU的STM.211、STM.211-ΔspvB、STM.211-ΔspvC、STM.211-ΔspvB.spvC。造模完成后觀察小鼠精神狀態(tài)、運(yùn)動情況、腹瀉、體重、毛發(fā)改變等感染中毒癥狀,于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d,每組隨機(jī)取5只小鼠摘眼球取血,用ELISA法測定血清IL-10、IL-12、IFN-γ水平;并分離小鼠肝、脾,觀察靶器官大體觀及顯微鏡下的病理改變。結(jié)果:1.成功構(gòu)建了穩(wěn)定的鼠傷寒沙門菌spvB.spvC基因共同缺陷株(STM.211-ΔspvB.spvC),PCR及測序分析證實spvB.spvC基因共同缺陷株中編碼區(qū)有1965個堿基缺失。2.BALB/c小鼠在感染沙門菌后第1天不同程度的出現(xiàn)聚集蜷縮、運(yùn)動減少、精神萎靡,毛發(fā)疏松,部分小鼠出現(xiàn)激惹癥狀,第3-5天時癥狀最明顯,但均無腹瀉癥狀。STM.211、STM.211-ΔspvB和STM.211-ΔspvC組的中毒癥狀明顯較PBS組嚴(yán)重,STM.211-ΔspvB.spvC組與PBS組間無明顯差異;沙門菌感染后,IFN-γ和IL-12分泌量顯著增高,而IL-10升高的程度較低,產(chǎn)生以Th1優(yōu)勢應(yīng)答為主的免疫反應(yīng),但不同菌株感染組間細(xì)胞因子分泌存在差異,STM.211組、STM.211-ΔspvB組、STM.211-ΔspvC組的IFN-γ和IL-12分泌量均顯著低于STM.211-ΔspvB.spvC組(p0.05),而IL-10的分泌量明顯高于STM.211-ΔspvB.spvC組(p0.05);STM.211組、STM.211-ΔspvB組、STM.211-Δspv C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1.運(yùn)用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)同源重組法成功構(gòu)建鼠傷寒沙門菌spvB.spv C基因共同缺陷變異株;并為后續(xù)細(xì)胞實驗進(jìn)一步研究該基因的功能及疫苗的制備提供工具和手段。2.spvB/spvC基因相對抑制TH1細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12的分泌,促進(jìn)TH2細(xì)胞因子IL-10的分泌,使免疫應(yīng)答向TH2方向偏移,出現(xiàn)TH1/TH2漂移�？梢�,spvB/spvC基因具有轉(zhuǎn)換不同免疫應(yīng)答類型的功能,從而有利于病原菌抵抗和逃避宿主的免疫防御,加重感染結(jié)局。
【關(guān)鍵詞】：鼠傷寒沙門菌 spvB spvC 基因敲除 免疫應(yīng)答
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R155.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 前言11-13
• 第一章 鼠傷寒沙門菌spvB.spvC基因共同缺陷株的構(gòu)建13-25
• 1 材料與方法13-20
• 1.1 實驗材料13-15
• 1.1.1 菌株和質(zhì)粒13
• 1.1.2 主要試劑13-14
• 1.1.3 培養(yǎng)基及液體試劑配制14
• 1.1.4 主要儀器14-15
• 1.2 方法15-20
• 1.2.1 PCR引物設(shè)計及合成15
• 1.2.2 spvB基因上游片段、spvC基因下游片段的獲取15-17
• 1.2.3 重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建17-19
• 1.2.4 鼠傷寒沙門菌spvB.spvC基因共同缺陷株的制備19-20
• 2 結(jié)果20-22
• 2.1 spvB基因上游和spvC基因下游片段的擴(kuò)增20
• 2.2 spvB.spvC共同缺陷核苷酸的克隆20-21
• 2.3 spvB.spvC共同缺陷核苷酸克隆至沙門菌21
• 2.4 突變株的誘導(dǎo)、篩選及鑒定21-22
• 3 討論22-25
• 第二章 spvB/spvC基因?qū)γ庖吖δ�、靶器官病理改變的影�?/span>25-37
• 1 材料與方法25-29
• 1.1 實驗材料25-27
• 1.1.1 細(xì)菌25-26
• 1.1.2 動物26
• 1.1.3 主要試劑、設(shè)備及器材:26-27
• 1.2 實驗方法27-28
• 1.2.1 模型建立27
• 1.2.2 小鼠肝、脾臟器的病理切片27-28
• 1.2.3 ELISA法檢測血清細(xì)胞因子28
• 1.3 數(shù)據(jù)分析28-29
• 2 結(jié)果29-34
• 2.1 感染后小鼠的感染中毒癥狀29
• 2.2 小鼠肝臟和脾臟的病理變化29-31
• 2.3 小鼠血清IL-10、IL-12和IFN-γ 水平檢測31-34
• 3 討論34-36
• 4 小結(jié)36-37
• 致謝37-38
• 參考文獻(xiàn)38-43
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文43
• 本課題所獲的基金資助43-44
• 綜述44-52
• 參考文獻(xiàn)49-52

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉曉艷;鼠傷寒沙門菌spvB.spvC基因共同缺陷變異株的構(gòu)建及spvB、spvC基因?qū)χ卸景Y狀、免疫功能的影響[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2015年

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本文編號：693363