本文關(guān)鍵詞：芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷對AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷模型作用機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 高血壓 HUVEC 芹菜苷 3-甲氧基芹菜苷 Ang Ⅱ ERK1/2信號通路

【摘要】：本文首先利用血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)建立氧化損傷模型模擬體外高血壓細(xì)胞損傷模型,其次通過考察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、微觀結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡以及檢測細(xì)胞功能中氧化損傷標(biāo)志物丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力來評價芹菜苷與3-甲氧基芹菜苷的修復(fù)效果,進(jìn)而選取功能活性較強(qiáng)的芹菜苷,再通過實(shí)時熒光定量PCR(real-time PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)等技術(shù)來研明芹菜苷對血壓調(diào)節(jié)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)信號通路的影響,從而闡明芹菜苷在血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮修復(fù)作用的途徑,為芹菜黃酮調(diào)節(jié)血壓研究提供理論基礎(chǔ),同時為高血壓病患者日常膳食提供有效的建議。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論如下：(1)以HUVECs為模型細(xì)胞,Ang Ⅱ?yàn)檎T導(dǎo)劑,篩選誘導(dǎo)劑的濃度和誘導(dǎo)時間對HUVECs氧化應(yīng)激損傷的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ能明顯的誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷,主要表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)變化,細(xì)胞器細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷,細(xì)胞活性下降,凋亡率上升,細(xì)胞脂質(zhì)過氧化增加,細(xì)胞的分泌功能如NO釋放率、eNOS、SOD活力降低。其中1μmol/L AngⅡI誘導(dǎo)12 h時各項(xiàng)指標(biāo)為細(xì)胞活性為65.11%,NO含量43.57 μmol/L, TNOS活力為6.99U/mgprot, eNOS活力為1.89U/mgprot,MDA含量為7.46 nmol/mgprot, SOD活力為144.88U/mgprot,細(xì)胞凋亡率為(41.5±2.6)%,微觀結(jié)構(gòu)顯示核膜皺縮,核仁消失,胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡狀結(jié)構(gòu),線粒體或者細(xì)小或者腫脹,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張數(shù)目較少,部分核糖體丟失,平面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,但細(xì)胞未解體,仍然保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)。(2)以芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷標(biāo)準(zhǔn)品為研究對象,通過與建立損傷模型相同的技術(shù)考察兩者對模型的修復(fù)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者均可以增加細(xì)胞活力,增加NO釋放量,清除自由基,減少細(xì)胞內(nèi)過氧化物的產(chǎn)生,降低細(xì)胞凋亡率,修復(fù)細(xì)胞器細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等,且上述功能在芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷濃度低于50 μmol/L時隨時間呈劑量依賴增加關(guān)系,高于50 μmol/L時修復(fù)細(xì)胞的功效開始降低。說明兩者均具有一定程度的修復(fù)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞作用。具體結(jié)果為：50 μmol/L芹菜苷修復(fù)12h時,各指標(biāo)分別為細(xì)胞活力79.07%,NO含量為139.22 μmol/L, TNOS活力為26.32 U/mgprot, eNOS活力為16.32 U/mgprot, MDA含量為5.47 nmol/mgprot, SOD活力為51.51 U/mgprot,細(xì)胞凋亡率下降到(14.7±1.2)%,微觀結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞核仁基本完整,胞漿內(nèi)空泡減少,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體數(shù)目未見減少,形態(tài)未見明顯病變。50μmol/L3-甲氧基芹菜苷修復(fù)12 h時,各指標(biāo)分別為細(xì)胞活力64.50%,NO含量為78.88 μmol/L, TNOS活力為19.94 U/mgprot, eNOS活力為12.41 U/mgprot,MDA含量為7.93 nmol/mgprot, SOD活力為44.32 U/mgprot,細(xì)胞凋亡率下降到(33.7±1.7)%,微觀結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞器數(shù)量減少,仍有部分線粒體腫脹。說明3-甲氧基芹菜苷在一定程度上同樣具有減緩血壓癥狀的作用,其發(fā)揮作用的規(guī)律與芹菜苷類似,但效果不如芹菜苷。綜合兩者的作用效果,最終選擇50 μmol/L芹菜苷修復(fù)12 h來研究芹菜苷對ERK1/2信號通路的作用。(3)ERK1/2信號通路是與高血壓相關(guān)的信號通路之一。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在AngⅡ誘導(dǎo)的模型中加入芹菜苷,ERK1、ERK2的mRNA表達(dá)分別降低7.84%、22.28%,磷酸化蛋白表達(dá)分別降低30.91%、11.33%,說明芹菜苷可以抑制磷酸化ERK1、ERK2的mRNA和蛋白表達(dá)來發(fā)揮降血壓作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)芹菜苷能夠抑制ERK1/2的下游產(chǎn)物ACE的mRNA和蛋白表達(dá),進(jìn)而減少細(xì)胞損傷,同時芹菜苷能夠激活eNOS的mRNA和蛋白表達(dá),發(fā)揮釋放NO的作用,從而修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。這種效果在加入ERK1/2特異性抑制劑U0126后更為明顯。
【關(guān)鍵詞】：高血壓 HUVEC 芹菜苷 3-甲氧基芹菜苷 Ang Ⅱ ERK1/2信號通路
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R151
【目錄】：

• 摘要2-4
• ABSTRACT4-9
• 符號說明9-10
• 第一章 緒論10-20
• 1.1 細(xì)胞氧化損傷模型10-11
• 1.1.1 細(xì)胞氧化損傷10
• 1.1.2 細(xì)胞模型的建立10-11
• 1.1.3 細(xì)胞模型的應(yīng)用11
• 1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷模型11-14
• 1.2.1 內(nèi)皮細(xì)胞概述12
• 1.2.2 內(nèi)皮細(xì)胞與高血壓的關(guān)系12
• 1.2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞特點(diǎn)12-13
• 1.2.4 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制13-14
• 1.3 黃酮類化合物功效14-15
• 1.4 芹菜黃酮功效15-17
• 1.5 黃酮類物質(zhì)對ERK1/2信號通路的調(diào)控17-18
• 1.6 研究目的與意義18
• 1.7 研究內(nèi)容18-20
• 第二章 ANG Ⅱ體外誘導(dǎo)HUVECS氧化損傷模型的建立20-40
• 2.1 材料與儀器20-22
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑20-21
• 2.1.3 主要儀器和設(shè)備21
• 2.1.4 主要試劑制備21-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-29
• 2.2.1 HUVECs的培養(yǎng)22-23
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理23
• 2.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察23
• 2.2.4 細(xì)胞活性測定23-24
• 2.2.5 總蛋白提取與濃度測定24-25
• 2.2.6 NO的測定25
• 2.2.7 NOS的測定25-26
• 2.2.8 MDA的測定26-27
• 2.2.9 SOD的測定27-28
• 2.2.10 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察28
• 2.2.11 細(xì)胞凋亡測定28-29
• 2.2.12 數(shù)據(jù)分析29
• 2.3 結(jié)果與討論29-37
• 2.3.1 細(xì)胞形態(tài)的觀察29-30
• 2.3.2 細(xì)胞活性30
• 2.3.3 總蛋白含量30-31
• 2.3.4 NO含量31-32
• 2.3.5 NOS活力32-33
• 2.3.6 MDA含量33-34
• 2.3.7 SOD活力34
• 2.3.8 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)34-36
• 2.3.9 細(xì)胞凋亡36-37
• 2.4 討論37-38
• 2.5 小結(jié)38-40
• 第三章 芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷對HUVECS氧化損傷模型的修復(fù)40-55
• 3.1 材料、試劑與儀器40-41
• 3.1.1 主要試劑40
• 3.1.2 主要儀器40-41
• 3.2 試驗(yàn)方法41-42
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理41-42
• 3.2.2 各指標(biāo)測定方法42
• 3.2.3 數(shù)據(jù)分析42
• 3.3 結(jié)果與討論42-52
• 3.3.1 細(xì)胞形態(tài)42-43
• 3.3.2 細(xì)胞活性43-44
• 3.3.3 總蛋白含量44
• 3.3.4 NO的含量44-46
• 3.3.5 NOS的活力46-47
• 3.3.6 MDA的含量47-49
• 3.3.7 SOD的活力49-50
• 3.3.8 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)50-51
• 3.3.9 細(xì)胞凋亡51-52
• 3.4 討論52-54
• 3.5 小結(jié)54-55
• 第四章 芹菜苷對HUVECS損傷模型中ERK1/2信號通路的作用55-72
• 4.1 材料、試劑與儀器55-56
• 4.1.1 試驗(yàn)材料55
• 4.1.2 主要試劑55-56
• 4.1.3 主要儀器56
• 4.2 試驗(yàn)方法56-64
• 4.2.1 試劑配制56-57
• 4.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)57
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理57-58
• 4.2.4 實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)58-61
• 4.2.5 免疫蛋白印跡(Western blotting)61-63
• 4.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析63-64
• 4.3 結(jié)果與討論64-69
• 4.3.1 ERK1/2 mRNA的溶解曲線64
• 4.3.2 芹菜苷對細(xì)胞中ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)量的影響64-67
• 4.3.3 ACE mRNA的溶解曲線67
• 4.3.4 芹菜苷對細(xì)胞中ACE mRNA表達(dá)量的影響67-68
• 4.3.5 芹菜苷對細(xì)胞中eNOS mRNA、蛋白表達(dá)量的影響68-69
• 4.4 討論69-70
• 4.5 小結(jié)70-72
• 全文總結(jié)72-74
• 參考文獻(xiàn)74-81
• 致謝81-82

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 賈佳;謝靜莉;許學(xué)書;;芹菜苷體外活性的研究[J];食品科學(xué);2008年12期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 毛文東;芹菜苷對HUVEC高血壓損傷模型作用機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

2 孫貝貝;芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷對AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷模型作用機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

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本文編號：685642