本文關(guān)鍵詞：基于RNAi研究氟對TGF-β信號通路的影響

  更多相關(guān)文章： RNAi 支持細(xì)胞 TGF-β1 Smad2 Smad4 Smad6 Smad7 白介素-6 腫瘤壞死因子-α

【摘要】：[目的]本論文通過體外分離培養(yǎng)小鼠睪丸支持細(xì)胞,構(gòu)建siRNA抑制的支持細(xì)胞TGF-β1模型,并在此基礎(chǔ)上染氟,檢測相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)情況,探討TGF-β信號通路在氟影響支持細(xì)胞免疫豁免功能中的調(diào)節(jié)作用機理。[方法]本試驗建立siRNA抑制的支持細(xì)胞TGF-β1模型,運用qRT-PCR和Western Blot技術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染后的TGF-β1mRNA和蛋白,在驗證成功的基礎(chǔ)上再進(jìn)行染氟處理,應(yīng)用qRT-PCR和ELISA分別檢測TGF-β1、Smad2、Smad4、 Smad6和Smad7mRNA以及支持細(xì)胞分泌的免疫相關(guān)蛋白白介素-6和腫瘤壞死因子-α的表達(dá)情況。[結(jié)果](1)支持細(xì)胞培養(yǎng)鑒定結(jié)果：通過HE和姬姆薩染色,觀察支持細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況。進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞純度達(dá)90%,細(xì)胞活性良好,可以用于進(jìn)行模型建立。(2) siRNA最佳轉(zhuǎn)染濃度的篩選：用不同濃度(20、30、50、100nM)的熒光標(biāo)記的FAM-siRNA轉(zhuǎn)染支持細(xì)胞,根據(jù)綠色熒光強弱篩選siRNA的最佳轉(zhuǎn)染濃度,確定50nM選為siRNA的最佳轉(zhuǎn)染濃度。(3) si-TGF-β1有效干擾序列的篩選：三種si-TGF-β1采用50nnM的濃度轉(zhuǎn)染支持細(xì)胞,檢測TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)量,結(jié)果表明,siRNAl(si-TGF-β1-1)組和siRNA2 (si-TGF-β1-2)組對小鼠睪丸SCs蛋白TGF-β1的表達(dá)較空白對照組明顯降低,其中si-RNA1組的差異極顯著。(4) qRT-PCR結(jié)果：各試驗組TGF-β1, Smad2, Smad4, Smad6和Smad7的mRNA表達(dá)量和對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義,但都表現(xiàn)為降低的趨勢。(5) ELISA:結(jié)果顯示,IL-6蛋白表達(dá)水平在10-4M(mol/L)NaF和10-3M(mol/L)NaF兩組中與對照組相比差異顯著(**P0.01);與對照組相比,各處理組TNF-α的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)降低的趨勢,但差異不顯著。[結(jié)論]TGF-β信號通路在氟對睪丸支持細(xì)胞免疫豁免功能影響中起到了一定調(diào)控作用，可能是通過TGF-β超家族其它成員(TGF-β1除外)、Smad蛋白家族以及免疫相關(guān)蛋白IL-6和TNF-α實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：RNAi 支持細(xì)胞 TGF-β1 Smad2 Smad4 Smad6 Smad7 白介素-6 腫瘤壞死因子-α
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要6-7
• 前言7-9
• 1 文獻(xiàn)綜述9-17
• 1.1 小鼠睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)及其生物學(xué)功能研究進(jìn)展9-11
• 1.2 轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族與Smad蛋白家族11-13
• 1.3 RNAi與TGF-β113-17
• 2 試驗材料17-18
• 2.1 試驗動物細(xì)胞17
• 2.2 主要試劑與耗材17
• 2.3 主要儀器設(shè)備17-18
• 3 試驗方法18-24
• 3.1 試驗?zāi)Ｐ偷慕?/span>18-21
• 3.2 氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs TGF-β1信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的檢測21-24
• 3.3 應(yīng)用ELISA檢測氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs免疫相關(guān)蛋白表達(dá)的影響24
• 3.4 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析24
• 4 試驗結(jié)果24-30
• 4.1 睪丸SCs分離培養(yǎng)及染色結(jié)果24-25
• 4.2 siRNA最佳轉(zhuǎn)染濃度的篩選結(jié)果25-26
• 4.3 TGF-β1有效干擾序列的篩選結(jié)果26-28
• 4.4 氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs TGF-β1信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響28-29
• 4.5 氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs免疫相關(guān)蛋白表達(dá)影響的檢測結(jié)果29-30
• 5 分析與討論30-37
• 5.1 試驗?zāi)Ｐ偷慕?/span>30-32
• 5.2 氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs TGF-β1信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響32-34
• 5.3 氟對siRNA抑制的小鼠睪丸SCs免疫相關(guān)蛋白表達(dá)的影響34-37
• 全文結(jié)論37-38
• 英文縮略詞表38-40
• 參考文獻(xiàn)40-46
• Abstract46-48
• 致謝48

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本文編號：659973