本文關(guān)鍵詞：香煙煙霧致BEAS-2B細(xì)胞惡變過程中表觀遺傳改變研究

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【摘要】：目的：對(duì)永生化的人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)進(jìn)行體外香煙煙霧染毒,建立細(xì)胞體外染毒惡性轉(zhuǎn)化模型,觀察BEAS-2B細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化過程中相關(guān)抑癌基因的啟動(dòng)子甲基化情況和mRNA表達(dá)情況以及相關(guān)甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)情況,探究香煙煙霧致肺癌的發(fā)生機(jī)制,為篩選香煙煙霧致肺癌的早期分子標(biāo)志物提供理論依據(jù)。 方法：采用永生化的人支氣管上皮細(xì)胞株(BEAS-2B細(xì)胞)進(jìn)行體外染煙,在BEAS-2B細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),以5×104每皿的量接種于Transwell膜培養(yǎng)皿中培養(yǎng),次日將Transwell膜培養(yǎng)皿置于細(xì)胞氣體染毒裝置進(jìn)行香煙煙霧染毒,染毒裝置的氧氣濃度恒定在21%,水浴維持染毒腔溫度為37-C,結(jié)合文獻(xiàn)以及CCK--8結(jié)果確定合適的香煙煙霧染毒濃度以及染毒時(shí)間。細(xì)胞連續(xù)染毒兩次作為染毒一代,共染毒30代,傳代40代。分別檢測(cè)對(duì)照組和染毒代1代、10代、20代、30代細(xì)胞及各自傳代40代后其周期和凋亡率,ROS水平以及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)等細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的指標(biāo)。用Q-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)情況。用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測(cè)對(duì)照組細(xì)胞以及Sm20-40和Sm30-40中RASSF1A、p16、RARβ、hMLH1、 FHIT以及重復(fù)序列LINE-1基因的甲基化狀況并檢測(cè)RASSF1A、p16和FHIT基因的表達(dá)水平。 結(jié)果：(1)CCK.-8結(jié)果：CCK-8數(shù)據(jù)顯示隨著染煙濃度以及時(shí)間增加,細(xì)胞增殖抑制率也在不斷上升,最終我們選擇的染煙濃度為20%,染煙時(shí)間是10分鐘,在此條件下,細(xì)胞染煙后增殖抑制率在30%左右。(2)基礎(chǔ)指標(biāo)檢測(cè)：各染毒組細(xì)胞G1期比例均有所降低(P0.05),S期細(xì)胞比例均有所上升(P0.05)。細(xì)胞第一次染毒后凋亡率明顯升高(P0.05),但在染毒后期傳代的細(xì)胞凋亡率明顯降低,從Sm20-40到Sm30-40,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各染毒組細(xì)胞與對(duì)照組相比,ROS水平均出現(xiàn)上升趨勢(shì),且隨著染毒代數(shù)增加,出現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。(3)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化程度：細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,BEAS-2B細(xì)胞在軟瓊脂中有較小的克隆形成率,在10%左右,但隨著細(xì)胞染毒代數(shù)的增加以及傳代,軟瓊脂克隆形成率逐漸增高,染毒30代克隆形成率最高,可達(dá)50%以上(P0.05)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明染毒30代并傳代40代的BEAS-2B細(xì)胞已具有體外裸鼠成瘤能力,Sm30-40細(xì)胞裸鼠成瘤率達(dá)到40%。分離瘤體做病理分析可見瘤細(xì)胞大小不一,呈彌漫性分布,異型性,為低分化癌,對(duì)照組裸鼠瘤體病理分析未見異型性明顯的細(xì)胞。(4)基因表達(dá)以及甲基化狀況：染毒并傳代組細(xì)胞出現(xiàn)了DNMT1表達(dá)量下降的情況(P0.05)；而相反的,染毒組細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照組,DNMT3a表達(dá)量有不同程度的升高(P0.05),到染毒后期最高,呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。對(duì)RASSF1A、p16、RARβ、hMLH1、FHIT和LINE-1基因啟動(dòng)子特異位點(diǎn)的甲基化狀況檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組細(xì)胞RASSF1A、FHIT基因沒有甲基化的表達(dá),而染毒組細(xì)胞出現(xiàn)高甲基化狀態(tài)：LINE-1在對(duì)照組細(xì)胞中出現(xiàn)高甲基化狀態(tài),而在染毒組細(xì)胞中呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。 結(jié)論：1、確定了最佳染毒濃度以及時(shí)間,成功建立了體外染煙致BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的模型。2、染毒后細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞增殖失控,具備了惡性特征且具有裸鼠成瘤性。3、抑癌基因RASSFIA和FHIT啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)高甲基化狀態(tài),重復(fù)序列LINE-1則出現(xiàn)低甲基化狀態(tài),同時(shí)基因RASSF1A和FHIT的表達(dá)在染毒組發(fā)生了改變,這可能是香煙煙霧染毒導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制之一,也為篩選香煙煙霧致肺癌的早期分子標(biāo)志物提供了一定的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：BEAS-2B細(xì)胞 香煙煙霧 抑癌基因 甲基化
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R114;R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 引言9-11
• 第一部分 香煙煙霧染毒誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型建立及生物學(xué)特征研究11-20
• 材料與方法11-15
• 結(jié)果15-17
• 討論17-20
• 第二部分 香煙煙霧染毒誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡轉(zhuǎn)過程中細(xì)胞的惡性程度及甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)改變20-32
• 材料與方法20-25
• 結(jié)果25-30
• 討論30-32
• 第三部分 香煙煙霧染毒誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡轉(zhuǎn)過程中RASSF1A、p16、RARβ、hMLH1、FHIT和LINE-1基因甲基化及基因表達(dá)研究32-43
• 材料與方法32-37
• 結(jié)果37-40
• 討論40-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 綜述 癌危險(xiǎn)因素以及抑癌基因甲基化與肺癌的關(guān)系49-56
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 研究生期間科研經(jīng)歷發(fā)表的文章56-57
• 中英文縮寫詞表57-58
• 致謝58

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李瑛;孫金秀;;人支氣管上皮細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè));2007年05期

2 劉曉美;范亞光;姜勇;向劍;王繼先;孫志娟;任冠華;姚樹祥;常潤(rùn)生;趙永成;喬友林;周清華;;云錫礦工肺癌危險(xiǎn)因素的隊(duì)列研究[J];中國(guó)肺癌雜志;2013年04期

3 熊建文;肖化;張鎮(zhèn)西;;MTT法和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性之測(cè)試條件比較[J];激光生物學(xué)報(bào);2007年05期

4 楊娟;方小玲;;甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1,DNMT3a及DNMT3b在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年01期

5 于石成,姚樹祥,倪宗瓚,ＰｈｉｌｉｐＲ．Ｔａｙｌｏｒ,喬友林;高危人群粉塵、砷暴露與肺癌發(fā)病關(guān)系的隊(duì)列研究[J];中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;1997年04期

6 任一萍,李智;細(xì)胞凋亡與腫瘤[J];生物學(xué)雜志;1998年02期

7 何興舟;室內(nèi)燃煤空氣污染與肺癌及遺傳易感性——宣威肺癌病因?qū)W研究22年[J];實(shí)用腫瘤雜志;2001年06期

8 穆效群;王世平;譚壯生;湯瑜奐;;香煙毒性的體外篩檢方法研究[J];毒理學(xué)雜志;2008年05期

9 孫紅琰,龔詒芬,王全立,陳君石,楊陟華,杜芝燕;煙草甲基亞硝胺吡啶基丁酮誘發(fā)HPV-18永生化人類支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[J];衛(wèi)生研究;1999年02期

10 趙曉榮;真核生物細(xì)胞周期研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè));1999年03期

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本文編號(hào)：652668