本文關鍵詞：集中空調系統(tǒng)中弗朗西斯菌樣細菌的多相分類學研究和另弗朗西斯菌屬的建立

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【摘要】：目的弗朗西斯菌屬(Francisella)細菌是一種兼性細胞內寄生的革蘭陰性菌球桿菌。該菌屬模式菌種—土拉弗朗西斯菌,具有高度的致病能力和通過氣溶膠傳播的特性,被認為是一種潛在的生物恐怖細菌。其他的弗朗西斯菌種通常被認為是環(huán)境菌種、非致病菌或者機會性致病菌。近年來的研究發(fā)現,弗朗西斯菌廣泛存在于自然界的淡水、咸水源和土壤中,其中人工供水系統(tǒng)中集中空調冷卻水是一個新發(fā)現的生境。本研究旨在采用多相分類的方法,對分離自空調冷卻水的弗朗西斯菌樣細菌(SYSU 10HL1970、10HP457、10HL1938、10HP82-10、SYSU YG23)進行生理生化、化學和分子生物學鑒定,確定其分類地位,便于評估其毒力、致病性和通過集中空調系統(tǒng)傳播疾病的能力。方法1.經典分類采用傳統(tǒng)實驗方法進行氧化酶、觸酶實驗和H2S還原實驗等實驗,以及采用API 20NH、API ZYM和Rapid ID 32A的試劑盒進行生化實驗,E-test法檢測抗生素敏感性。選擇科內相近種的典型菌株F.philomiragia ATCC25015、F.guangzhouensis 08HL01032T作為參比菌株與供試菌株做平行實驗,進行比較分析。2.化學分類采用薄層色譜、高效液相色譜、氣相色譜方法測定供試菌株的極性脂、呼吸醌、脂肪酸組分,選擇科內相近種的典型菌株F.philomiragia ATCC25015、F.guangzhouensis 08HL01032T作為參比菌株與供試菌株做平行實驗,以比較分析。3.分子分類采用高效液相色譜(基因組DNA G+C mol%含量分析)、蛋白質譜、PCR擴增和基因測序相結合的核酸分析、DNA-DNA雜交等技術對供試菌株進行分子分類。根據分子分類的結果,該五株菌分類為2個菌群,SYSU YG23T和SYSU10HL1970T分別被指定為模式菌株(Type strain)。結果1.經典分類sysuyg23t、sysu10hl1970t、10hp457、10hl1938、10hp82-10五個供試菌株符合弗朗西斯菌科細菌的基本特征,其均為革蘭氏陰性球桿菌,氧化酶陰性、觸酶弱陽性且l-半胱氨酸能促進其生長(chab培養(yǎng)基和嗜血桿菌巧克力培養(yǎng)基上菌落大于血平板)。具有與弗朗西斯菌科細菌類似的藥敏特征:β-內酰酶試驗陽性,對頭孢菌素耐藥,對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類抗生素敏感。總體生化特征類似于廣州弗朗西斯菌,但存在一定差異,如蔗糖發(fā)酵、亮氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、苯丙氨酸芳胺酶。2.化學分類sysuyg23t、sysu10hl1970t、10hp457、10hl1938和10hp82-10五個供試菌株的極性脂和醌組主要組分相同,主要含有磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,pe)、雙磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol,dpg)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,pg)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,pc)、含氨基的未知磷脂(unidentifiedaminophospholipid,apl4,apl2)、未知磷脂(pl2,pl3和pl4)、未知糖脂(gl2)和少量的未知糖脂(gl1,gl3)。呼吸醌類型是q-8,主要脂肪酸成分是c10:0、c14:0、c16:0和兩個長鏈羥基脂肪酸c18:1ω9c和c18:13-oh,但在脂肪酸含量和種類上與參考菌株稍有不同,而且sysuyg23t和其它四個供試菌株在主要脂肪酸含量上有所區(qū)別,且sysuyg23t和其它四個供試菌株在主要脂肪酸含量上有所區(qū)別。3.分子分類16srrna基因比對結果顯示:sysu10hl1970t、10hl1938、10hp82-10和10hp457的相似度為100%,與sysuyg23t之間的相似度為98.6%;且兩者與廣州弗朗西斯菌08hl01032t的相似度最高,分別為98.87%和98.82%,但都與其他弗朗西斯菌種的相似度低于95.3%。以mp、nj和ml三種方法構建的16srrna基因系統(tǒng)發(fā)育樹均顯示:該5株菌與廣州弗朗西斯菌位于一個大的分枝上,與廣州弗朗西斯菌分別形成3個小枝,其中sysu10hl1970t、10hl1938、10hp82-10和10hp457形成一個進化枝,sysuyg23t單獨為一個枝。管家基因mdh、rpob和sdha擴增成功,長度分別是700bp、300bp和300bp�；趩蝹�管家基因及串聯管家基因的系統(tǒng)發(fā)育樹一致且與基于16srrna基因的系統(tǒng)發(fā)育樹一致。即三個管家基因測序分析的結果亦表明,該五株可分為2個進化群,其分別與廣州弗朗西斯菌親緣關系密切,但又與廣州弗朗西斯菌存在明顯的差異。MALDI-TOF MS的分析結果顯示,SYSU 10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457和存在特征的蛋白質譜峰5110m/z、6123m/z、9360m/z;SYSU YG23T存在特征的蛋白質譜峰5110m/z、4754m/z、6123m/z、9360m/z,且在4754m/z有峰,相對強度大于5110m/z峰相對強度。聚類分析顯示,SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457形成一個聚類群,SYSU YG23T單獨為一個聚類群�；诩毦蚪M的分析結果顯示:SYSU 10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457四株菌之間的雜交率80%,即該四株菌為同一個種;與SYSU YG23T的雜交率在低于70%,即該四株菌與SYSU YG23T分別屬于兩個不同的菌種。另外,該五株菌與已知親緣關系接近的廣州弗朗西斯菌08HL01032T和蜃樓弗朗西斯菌也低于70%,亦支持其新屬新種的分類地位。該兩個新屬新種的G+C mol%含量分別為:SYSU 10HL1970T的G+C mol%含量為30.0%,SYSU YG23T的G+C mol%含量為32.6%。結論根據經典分類、化學分類和分子分類的試驗結果,SYSU 10HL1970T(=KCTC42969=DSM 101835)、10HL1938、10HP82-10、10HP457四株菌和SYSU YG23T(=KCTC 42968=DSM 101834)為弗朗西斯菌科的兩個新屬新種。根據細菌新種的命名法則,分別命名為冷卻水另弗朗西斯菌(Allofrancisella frigidaquae)和意外另弗朗西斯菌(Allofrancisella inopinata)。另外,廣州弗朗西斯菌08HL01032T(F.guangzhouensi)與其他弗朗西斯菌種存在差異,但與兩個新屬新種存在有許多共同點,所以將廣州弗朗西斯菌重新劃分入另弗朗西斯菌屬內,命名為廣州另弗朗西斯菌(Allofrancisella guangzhouensis)。
【關鍵詞】：另弗朗西斯菌屬 系統(tǒng)發(fā)育分析 多相分類
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R115
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 縮略語/符號說明13-15
• 前言15-28
• 研究現狀、成果15-24
• 研究目的、方法24-28
• 一、弗朗西斯菌的形態(tài)學特征及生理生化特征研究28-41
• 1.1 對象與方法28-33
• 1.1.1 供試菌株28
• 1.1.2 主要儀器與試劑28-30
• 1.1.3 四種培養(yǎng)基30-31
• 1.1.4 方法31-33
• 1.2 結果33-39
• 1.2.1 形態(tài)學特征分析33-35
• 1.2.2 生理生化特征分析35-39
• 1.3 小結39-41
• 二、弗朗西斯菌的化學特征研究41-55
• 2.1 對象和方法41-42
• 2.1.1 供試菌株41
• 2.1.2 主要試劑與儀器41-42
• 2.2 方法42-54
• 2.2.1 磷酸類脂分析42-46
• 2.2.2 醌組組分分析46-48
• 2.2.3 全細胞脂肪酸分析48-54
• 2.3 小結54-55
• 三、弗朗西斯菌的遺傳學特征研究55-76
• 3.1 對象和方法55-56
• 3.1.1 供試菌株55
• 3.1.2 主要儀器與試劑55-56
• 3.2 方法56-74
• 3.2.1 16S rRNA基因及管家基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析56-66
• 3.2.2 基因組DNA(G+C)mol%測定66-68
• 3.2.3 基因組DNA-DNA同源性分析68-70
• 3.2.4 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)分析70-74
• 3.3 小結74-76
• 結論76-79
• 參考文獻79-85
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明85-86
• 綜述 基因時代下細菌的多相分類86-94
• 綜述參考文獻90-94
• 致謝94-95
• 個人簡歷95

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1 李營;集中空調系統(tǒng)中弗朗西斯菌樣細菌的多相分類學研究和另弗朗西斯菌屬的建立[D];天津醫(yī)科大學;2016年

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本文編號：647128