本文關(guān)鍵詞：RNA干擾技術(shù)研究五氯酚PCP對MCF-7細(xì)胞類固醇激素相關(guān)基因表達(dá)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：氯酚類化合物是一類由于不合理使用而普遍存在的環(huán)境污染物,在所有的氯酚類化合物中,五氯酚(PCP)較多地用于控制白蟻和保護(hù)木材。這些氯酚類化合物(尤其是PCP)高劑量的急性暴露具有致命的作用。PCP是穩(wěn)定持續(xù)地存在于環(huán)境中,如空氣、水和土壤中；此外還可以通過攝食、皮膚的吸收進(jìn)入到身體,從而增加了人類和嚙齒動物患癌的風(fēng)險。在哺乳動物和人類中,由PCP引發(fā)的毒性機制在體內(nèi)外中均有研究報道。PCP可能提高嚙齒動物致癌的風(fēng)險,人類的惡性淋巴瘤和白血病的發(fā)生可能也與職業(yè)暴露PCP有關(guān)聯(lián),并且PCP還具有內(nèi)分泌干擾物的活性,它可以影響鯽魚血清睪酮水平的表達(dá)。此外,有報道指出,高劑量的PCP可能造成生物體體溫升高、肝臟缺陷、免疫系統(tǒng)的損傷以及破壞正常性別、認(rèn)知、生理和情感的發(fā)育。目前關(guān)于PCP的毒性和它潛在的致癌性,國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)的研究,但是PCP對生物體的內(nèi)分泌干擾機制研究的很少,并且具體的分子機制問題也一直不清楚。因此,本課題主要選用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7(即陽性表達(dá)雌激素受體ERa)和人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS作為離體研究對象,研究PCP暴露對離體細(xì)胞MCF-7和U2-OS增殖效應(yīng)的影響,PCP暴露對MCF-7和U2-OS兩種細(xì)胞內(nèi)類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因表達(dá)的影響；此外,結(jié)合RNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等技術(shù),研究在MCF-7細(xì)胞中將ERa基因干擾后,PCP對MCF-7細(xì)胞中類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因的影響,從而探索PCP是通過受體(ERa)還是非受體途徑行使內(nèi)分泌干擾作用,以期從細(xì)胞、分子水平上研究并揭示PCP對生物體行使內(nèi)分泌干擾作用的機制。研究內(nèi)容主要包括以下部分： 1.研究PCP對MCF-7和U2-OS細(xì)胞的毒性作用,并確定PCP對這兩種細(xì)胞作用48h后的半致死率濃度。本研究先將MCF-7和U2-OS細(xì)胞暴露在不同濃度的PCP培養(yǎng)基中,以200μmol·L-1作為PCP最高作用濃度,稀釋因子為2,依次選取8個PCP作用濃度,作用24h和48h后,運用MTT法檢測PCP對這兩種細(xì)胞的增殖作用,并分析PCP作用兩種細(xì)胞48h的半致死率濃度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),PCP可以抑制MCF-7和U2-OS細(xì)胞的生長,并且具有一定的濃度效應(yīng)；PCP作用MCF-7和U2-OS兩種細(xì)胞48h的半致死率濃度分別為97.08μmol·L-1和90.23μmol·L-1。 2.檢測PCP對MCF-7和U2-OS細(xì)胞中類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因表達(dá)的影響,從而初步揭示PCP對生物體內(nèi)分泌干擾的作用機制。根據(jù)PCP對兩種細(xì)胞的毒性作用結(jié)果,選用6.25μmol·L-1、12.5μmol·L-1、25μmol·L-1和50μmol·L-1四個濃度的PCP對MCF-7細(xì)胞和U2-OS細(xì)胞作用48h,然后運用Real-time PCR檢測MCF-7及U2-OS細(xì)胞中類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因(CYP17、CYP19、StAR和17β-HSD12)mRNA表達(dá)的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同濃度的PCP均能抑制MCF-7細(xì)胞和U2-OS細(xì)胞中CYP17、StAR和17β-HSD12基因的表達(dá),初步說明PCP可以改變類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因的表達(dá)。有研究報道,PCP可以通過改變類固醇激素合成酶的表達(dá)改變機體產(chǎn)生激素的絕對和相對濃度及其比率,從而發(fā)揮干擾生物體內(nèi)分泌的作用。而CYP19基因在兩種細(xì)胞中的表達(dá)存在差異,在MCF-7細(xì)胞中,CYP19基因的表達(dá)先下降后上升；在U2-OS細(xì)胞中CYP19基因的表達(dá)呈現(xiàn)出上升效應(yīng),說明PCP對CYP19基因的影響可能存在組織和細(xì)胞的表達(dá)差異。 3.為了進(jìn)一步揭示PCP是通過與受體相互作用還是非受體即影響細(xì)胞內(nèi)類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因的表達(dá)而干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用。本研究采用RNAi技術(shù),對MCF-7細(xì)胞內(nèi)ERa基因進(jìn)行干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。設(shè)計4條ERa基因干擾序列并構(gòu)建到pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒上,且設(shè)計ERa基因的陰性干擾序列作為對照,通過測序鑒定,5條干擾序列成功構(gòu)建到pGPU6/GFP/Neo載體上。將構(gòu)建好的5條干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中,通過G418培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選,將篩選出的陽性細(xì)胞進(jìn)行鑒定。通過Real-time PCR和western blott對ERa在mRNA和蛋白水平進(jìn)行干擾效率鑒定,然后確定干擾效率最佳的細(xì)胞株。 4.利用Real-time PCR檢測不同濃度6.25μmol·L-1、12.5μmol·L-1、25μmol·L-1和50μmol·L-1的PCP對ERa基因干擾后的MCF-7細(xì)胞中類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因(CYP17、CYP19、StAR和17β-HSD12)的表達(dá)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在低濃度PCP作用時,可以抑制CYP17和StAR mRNA的表達(dá),但在高濃度PCP作用時,可以誘導(dǎo)CYP17和StAR mRNA表達(dá)。在6.25μmol·L-1和50μmol·L-1PCP作用時,CYP19mRNA被誘導(dǎo)；在12.5μmol·L-1PCP作用時,CYP19mRNA的表達(dá)卻受到了抑制。通過對比ERa基因干擾前后,MCF-7細(xì)胞中類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因的變化,初步得出結(jié)論,低濃度的PCP可能通過其他信號通路改變了類固醇激素合成酶基因的表達(dá),造成內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂；高濃度的PCP可能一部分會直接與ERa相互作用引起內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂。通過以上研究從細(xì)胞、分子水平上揭示PCP對生物體內(nèi)分泌干擾的作用機制。
【關(guān)鍵詞】：五氯酚 MCF-7細(xì)胞 U2-OS細(xì)胞 RNAi 類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

• ~.寫與符號5-7
• 摘要7-9
• Abstracts9-12
• 第1章 文獻(xiàn)綜述12-22
• 1.1 五氯酚的污染現(xiàn)狀12-13
• 1.2 五氯酚對生物體的毒性研究13-14
• 1.3 五氯酚干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的研究14-17
• 1.3.1 受體介導(dǎo)反應(yīng)15-16
• 1.3.2 非受體介導(dǎo)反應(yīng)16
• 1.3.3 影響內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)的綜合效應(yīng)16-17
• 1.4 RNA干擾技術(shù)的簡介17-19
• 1.4.1 RNAi的作用機制與特點17-18
• 1.4.2 RNAi的應(yīng)用18-19
• 1.5 類固醇合成酶關(guān)鍵基因的功能研究19-22
• 1.5.1 CYP1719-20
• 1.5.2 CYP1920
• 1.5.3 StAR20-21
• 1.5.4 17β-HSD21-22
• 第2章 緒論22-26
• 2.1 選題的背景及意義22
• 2.2 研究目的和主要研究內(nèi)容22-23
• 2.2.1 研究目的22-23
• 2.2.2 研究內(nèi)容23
• 2.3 創(chuàng)新之處23-24
• 2.4 技術(shù)路線24-26
• 第3章 五氯酚對MCF-7和U2-OS細(xì)胞中類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因的影響26-40
• 3.1 引言26
• 3.2 實驗材料26-27
• 3.3 實驗方法27-33
• 3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)27
• 3.3.2 細(xì)胞凍存27-28
• 3.3.3 MTT法檢測MCF-7和U2-OS細(xì)胞的抑制作用28
• 3.3.4 細(xì)胞總RNA的提取28-30
• 3.3.5 cDNA樣品的制備30-31
• 3.3.6 熒光定量RCR的引物的設(shè)計合成與檢測31-32
• 3.3.7 Real-time PCR32-33
• 3.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析33
• 3.4 實驗結(jié)果33-37
• 3.4.1 MTT法檢測MCF-7和U2-OS細(xì)胞抑制的結(jié)果33-34
• 3.4.2 細(xì)胞總RNA提取結(jié)果34-35
• 3.4.3 PCP對MCF-7細(xì)胞中類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因表達(dá)的影響35-36
• 3.4.4 PCP對U2-OS細(xì)胞中類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因表達(dá)的影響36-37
• 3.5 討論37-39
• 3.6 結(jié)論39-40
• 第4章 PCP對ERa基因干擾后的MCF-7細(xì)胞中類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因的影響40-52
• 4.1 前言40
• 4.2 實驗材料40-41
• 4.3 實驗方法41-45
• 4.3.1 ERa RNA干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建41-42
• 4.3.2 G418篩選穩(wěn)定表達(dá)的MCF-7細(xì)胞系42
• 4.3.3 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染42-43
• 4.3.4 Real-time PCR檢測ER a mRNA的表達(dá)43-44
• 4.3.5 western印跡法檢測RNAi后ERa蛋白的表達(dá)44-45
• 4.3.6 Real-time PCR檢測PCP對MCF-7細(xì)胞中ER a干擾后類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因表達(dá)的影響45
• 4.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析45
• 4.4 實驗結(jié)果45-48
• 4.4.1 Real-time PCR檢測干擾質(zhì)粒對MCF-7細(xì)胞中ER a mRNA表達(dá)的影響45-46
• 4.4.2 western免疫印跡法檢測干擾質(zhì)粒對MCF-7細(xì)胞中ER a蛋白表達(dá)的影響46-47
• 4.4.3 PCP對MCF-7細(xì)胞中ER a干擾后類固醇激素合成酶關(guān)鍵基因表達(dá)的影響47-48
• 4.5 討論48-50
• 4.6 結(jié)論50-52
• 第5章 全文總結(jié)和展望52-54
• 5.1 全文總結(jié)52-53
• 5.2 展望53-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 致謝62-64
• 附錄64

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳雙;魏雪濤;郝衛(wèi)東;;雙酚A和敵匹硫磷對MCF-7細(xì)胞增殖的影響及其聯(lián)合作用研究[J];癌變.畸變.突變;2009年04期

2 李維仁;韓勃萱;劉濤;李廣永;周峰;鞏艷青;高U喼，

本文編號：489983