本文關鍵詞：RNA干擾技術研究五氯酚PCP對MCF-7細胞類固醇激素相關基因表達的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：氯酚類化合物是一類由于不合理使用而普遍存在的環(huán)境污染物,在所有的氯酚類化合物中,五氯酚(PCP)較多地用于控制白蟻和保護木材。這些氯酚類化合物(尤其是PCP)高劑量的急性暴露具有致命的作用。PCP是穩(wěn)定持續(xù)地存在于環(huán)境中,如空氣、水和土壤中；此外還可以通過攝食、皮膚的吸收進入到身體,從而增加了人類和嚙齒動物患癌的風險。在哺乳動物和人類中,由PCP引發(fā)的毒性機制在體內外中均有研究報道。PCP可能提高嚙齒動物致癌的風險,人類的惡性淋巴瘤和白血病的發(fā)生可能也與職業(yè)暴露PCP有關聯(lián),并且PCP還具有內分泌干擾物的活性,它可以影響鯽魚血清睪酮水平的表達。此外,有報道指出,高劑量的PCP可能造成生物體體溫升高、肝臟缺陷、免疫系統(tǒng)的損傷以及破壞正常性別、認知、生理和情感的發(fā)育。目前關于PCP的毒性和它潛在的致癌性,國內外學者已經進行了相關的研究,但是PCP對生物體的內分泌干擾機制研究的很少,并且具體的分子機制問題也一直不清楚。因此,本課題主要選用人乳腺癌細胞MCF-7(即陽性表達雌激素受體ERa)和人骨肉瘤細胞U2-OS作為離體研究對象,研究PCP暴露對離體細胞MCF-7和U2-OS增殖效應的影響,PCP暴露對MCF-7和U2-OS兩種細胞內類固醇激素合成酶關鍵基因表達的影響；此外,結合RNA干擾和質粒轉染等技術,研究在MCF-7細胞中將ERa基因干擾后,PCP對MCF-7細胞中類固醇激素合成酶關鍵基因的影響,從而探索PCP是通過受體(ERa)還是非受體途徑行使內分泌干擾作用,以期從細胞、分子水平上研究并揭示PCP對生物體行使內分泌干擾作用的機制。研究內容主要包括以下部分： 1.研究PCP對MCF-7和U2-OS細胞的毒性作用,并確定PCP對這兩種細胞作用48h后的半致死率濃度。本研究先將MCF-7和U2-OS細胞暴露在不同濃度的PCP培養(yǎng)基中,以200μmol·L-1作為PCP最高作用濃度,稀釋因子為2,依次選取8個PCP作用濃度,作用24h和48h后,運用MTT法檢測PCP對這兩種細胞的增殖作用,并分析PCP作用兩種細胞48h的半致死率濃度。研究結果發(fā)現(xiàn),PCP可以抑制MCF-7和U2-OS細胞的生長,并且具有一定的濃度效應；PCP作用MCF-7和U2-OS兩種細胞48h的半致死率濃度分別為97.08μmol·L-1和90.23μmol·L-1。 2.檢測PCP對MCF-7和U2-OS細胞中類固醇激素合成酶關鍵基因表達的影響,從而初步揭示PCP對生物體內分泌干擾的作用機制。根據(jù)PCP對兩種細胞的毒性作用結果,選用6.25μmol·L-1、12.5μmol·L-1、25μmol·L-1和50μmol·L-1四個濃度的PCP對MCF-7細胞和U2-OS細胞作用48h,然后運用Real-time PCR檢測MCF-7及U2-OS細胞中類固醇激素合成酶關鍵基因(CYP17、CYP19、StAR和17β-HSD12)mRNA表達的影響。研究結果發(fā)現(xiàn),不同濃度的PCP均能抑制MCF-7細胞和U2-OS細胞中CYP17、StAR和17β-HSD12基因的表達,初步說明PCP可以改變類固醇激素合成酶關鍵基因的表達。有研究報道,PCP可以通過改變類固醇激素合成酶的表達改變機體產生激素的絕對和相對濃度及其比率,從而發(fā)揮干擾生物體內分泌的作用。而CYP19基因在兩種細胞中的表達存在差異,在MCF-7細胞中,CYP19基因的表達先下降后上升；在U2-OS細胞中CYP19基因的表達呈現(xiàn)出上升效應,說明PCP對CYP19基因的影響可能存在組織和細胞的表達差異。 3.為了進一步揭示PCP是通過與受體相互作用還是非受體即影響細胞內類固醇激素合成酶關鍵基因的表達而干擾內分泌系統(tǒng)的作用。本研究采用RNAi技術,對MCF-7細胞內ERa基因進行干擾質粒的轉染。設計4條ERa基因干擾序列并構建到pGPU6/GFP/Neo質粒上,且設計ERa基因的陰性干擾序列作為對照,通過測序鑒定,5條干擾序列成功構建到pGPU6/GFP/Neo載體上。將構建好的5條干擾質粒分別轉染到MCF-7細胞中,通過G418培養(yǎng)基對轉染細胞進行篩選,將篩選出的陽性細胞進行鑒定。通過Real-time PCR和western blott對ERa在mRNA和蛋白水平進行干擾效率鑒定,然后確定干擾效率最佳的細胞株。 4.利用Real-time PCR檢測不同濃度6.25μmol·L-1、12.5μmol·L-1、25μmol·L-1和50μmol·L-1的PCP對ERa基因干擾后的MCF-7細胞中類固醇激素合成酶關鍵基因(CYP17、CYP19、StAR和17β-HSD12)的表達。研究結果發(fā)現(xiàn),在低濃度PCP作用時,可以抑制CYP17和StAR mRNA的表達,但在高濃度PCP作用時,可以誘導CYP17和StAR mRNA表達。在6.25μmol·L-1和50μmol·L-1PCP作用時,CYP19mRNA被誘導；在12.5μmol·L-1PCP作用時,CYP19mRNA的表達卻受到了抑制。通過對比ERa基因干擾前后,MCF-7細胞中類固醇激素合成酶關鍵基因的變化,初步得出結論,低濃度的PCP可能通過其他信號通路改變了類固醇激素合成酶基因的表達,造成內分泌系統(tǒng)的紊亂；高濃度的PCP可能一部分會直接與ERa相互作用引起內分泌系統(tǒng)的紊亂。通過以上研究從細胞、分子水平上揭示PCP對生物體內分泌干擾的作用機制。
【關鍵詞】：五氯酚 MCF-7細胞 U2-OS細胞 RNAi 類固醇激素合成酶關鍵基因
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

• ~.寫與符號5-7
• 摘要7-9
• Abstracts9-12
• 第1章 文獻綜述12-22
• 1.1 五氯酚的污染現(xiàn)狀12-13
• 1.2 五氯酚對生物體的毒性研究13-14
• 1.3 五氯酚干擾內分泌系統(tǒng)的研究14-17
• 1.3.1 受體介導反應15-16
• 1.3.2 非受體介導反應16
• 1.3.3 影響內分泌系統(tǒng)、神經系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)的綜合效應16-17
• 1.4 RNA干擾技術的簡介17-19
• 1.4.1 RNAi的作用機制與特點17-18
• 1.4.2 RNAi的應用18-19
• 1.5 類固醇合成酶關鍵基因的功能研究19-22
• 1.5.1 CYP1719-20
• 1.5.2 CYP1920
• 1.5.3 StAR20-21
• 1.5.4 17β-HSD21-22
• 第2章 緒論22-26
• 2.1 選題的背景及意義22
• 2.2 研究目的和主要研究內容22-23
• 2.2.1 研究目的22-23
• 2.2.2 研究內容23
• 2.3 創(chuàng)新之處23-24
• 2.4 技術路線24-26
• 第3章 五氯酚對MCF-7和U2-OS細胞中類固醇激素合成酶關鍵基因的影響26-40
• 3.1 引言26
• 3.2 實驗材料26-27
• 3.3 實驗方法27-33
• 3.3.1 細胞培養(yǎng)27
• 3.3.2 細胞凍存27-28
• 3.3.3 MTT法檢測MCF-7和U2-OS細胞的抑制作用28
• 3.3.4 細胞總RNA的提取28-30
• 3.3.5 cDNA樣品的制備30-31
• 3.3.6 熒光定量RCR的引物的設計合成與檢測31-32
• 3.3.7 Real-time PCR32-33
• 3.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析33
• 3.4 實驗結果33-37
• 3.4.1 MTT法檢測MCF-7和U2-OS細胞抑制的結果33-34
• 3.4.2 細胞總RNA提取結果34-35
• 3.4.3 PCP對MCF-7細胞中類固醇激素合成酶關鍵基因表達的影響35-36
• 3.4.4 PCP對U2-OS細胞中類固醇激素合成酶關鍵基因表達的影響36-37
• 3.5 討論37-39
• 3.6 結論39-40
• 第4章 PCP對ERa基因干擾后的MCF-7細胞中類固醇激素合成酶關鍵基因的影響40-52
• 4.1 前言40
• 4.2 實驗材料40-41
• 4.3 實驗方法41-45
• 4.3.1 ERa RNA干擾質粒載體的構建41-42
• 4.3.2 G418篩選穩(wěn)定表達的MCF-7細胞系42
• 4.3.3 質粒的轉染42-43
• 4.3.4 Real-time PCR檢測ER a mRNA的表達43-44
• 4.3.5 western印跡法檢測RNAi后ERa蛋白的表達44-45
• 4.3.6 Real-time PCR檢測PCP對MCF-7細胞中ER a干擾后類固醇激素合成酶關鍵基因表達的影響45
• 4.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析45
• 4.4 實驗結果45-48
• 4.4.1 Real-time PCR檢測干擾質粒對MCF-7細胞中ER a mRNA表達的影響45-46
• 4.4.2 western免疫印跡法檢測干擾質粒對MCF-7細胞中ER a蛋白表達的影響46-47
• 4.4.3 PCP對MCF-7細胞中ER a干擾后類固醇激素合成酶關鍵基因表達的影響47-48
• 4.5 討論48-50
• 4.6 結論50-52
• 第5章 全文總結和展望52-54
• 5.1 全文總結52-53
• 5.2 展望53-54
• 參考文獻54-62
• 致謝62-64
• 附錄64

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳雙;魏雪濤;郝衛(wèi)東;;雙酚A和敵匹硫磷對MCF-7細胞增殖的影響及其聯(lián)合作用研究[J];癌變.畸變.突變;2009年04期

2 李維仁;韓勃萱;劉濤;李廣永;周峰;鞏艷青;高U喼，

本文編號：489983