本文關(guān)鍵詞：金屬硫蛋白對氧糖剝奪再灌注誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：金屬硫蛋白（Metallothionein, MT）是一類富含半胱氨酸，，分子量較低的金屬結(jié)合蛋白，具有解毒重金屬、調(diào)節(jié)必需金屬自穩(wěn)和抗氧化應(yīng)激的功能。目前研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)MT共有四種亞型，其中MT-1、 MT-II（MT-I/II）和MT-III是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要異構(gòu)形式。MT-I/II主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，MT-III主要表達(dá)于神經(jīng)元。近年來越來越多的研究表明MT-I/II在腦缺血等疾病中有重要的神經(jīng)保護(hù)功能，但其具體作用靶位和機(jī)制均還不清楚。 目的：本課題應(yīng)用MT-I/II基因敲除（MT-/-）小鼠和野生型（MT+/+）小鼠，分別建立原代培養(yǎng)的新生小鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞模型，并通過細(xì)胞胞氧糖剝奪培養(yǎng)（Oxygen glucose deprivation, OGD）和再復(fù)糖復(fù)氧，即再灌注（Reperfusion,Rep）建立體外模擬缺血再灌注模型，旨在闡明MT-I/II對OGD/Rep誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的作用并探討其可能的作用機(jī)制；同時(shí)觀察了MT-I/II在外源性化合物（白藜蘆醇）介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)中的作用。 方法與結(jié)果：分別應(yīng)用C57BL/OLA129MT+/+和MT-/-新生小鼠，建立腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞體外原代培養(yǎng)模型，并針對星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白（GFAP）應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞純度鑒定。結(jié)果表明，培養(yǎng)細(xì)胞純度可達(dá)到90%以上，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)表明，MT+/+和MT-/-小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長、形態(tài)學(xué)等特征均基本相似，提示生理?xiàng)l件下MT-I/II基因敲除對星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能沒有顯著影響。對MT+/+和MT-/-小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分別進(jìn)行氧糖剝奪再灌注實(shí)驗(yàn)，通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化，檢測細(xì)胞存活率、細(xì)胞乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出率及細(xì)胞凋亡率來評價(jià)MT對OGD/Rep所致星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性的影響。結(jié)果顯示，OGD對星形膠質(zhì)細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性，且Rep過程會(huì)加劇細(xì)胞損傷。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生皺縮、體積變小、核周空泡化及細(xì)胞死亡，細(xì)胞存活率下降，LDH漏出率和細(xì)胞凋亡率明顯增加。且MT-/-小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷程度明顯高于MT+/+型細(xì)胞，該結(jié)果表明MT的缺失使星形膠質(zhì)細(xì)胞對OGD/Rep引起的細(xì)胞損傷更為敏感，可見MT-I/II對OGD/Rep引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。 白藜蘆醇是一種多酚類化合物，近年來研究表明白藜蘆醇對腦缺血損傷具有明顯的保護(hù)作用，并提示其作用機(jī)制與MT-I/II密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制尚不清楚。為了進(jìn)一步證實(shí)MT在白藜蘆醇介導(dǎo)的抗腦缺血損傷中的作用，我們分別將白藜蘆醇加入MT+/+和MT-/-小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞模型，旨在闡明白藜蘆醇是否通過調(diào)節(jié)MT來發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。MT+/+星形膠質(zhì)細(xì)胞給予不同濃度的白藜蘆醇（10nM、100nM、1μM、10μM）處理，經(jīng)過OGD/Rep后觀察其形態(tài)學(xué)改變，選取合適濃度（10μM）進(jìn)行下一步研究。對MT+/+和MT-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞給予10μM白藜蘆醇處理并進(jìn)行OGD/Rep，在形態(tài)學(xué)觀察上得出白藜蘆醇有效改善了MT+/+細(xì)胞空泡化和死亡的發(fā)生。通過對LDH漏出率的測定及與未加入白藜蘆醇組進(jìn)行比較，在加入了保護(hù)性藥物Res后，LDH漏出有一定的降低，且對MT+/+的作用更明顯，尤其在Rep階段（P0.05），明顯降低了LDH漏出率，體現(xiàn)了Res的保護(hù)作用。 為檢測細(xì)胞的氧化損傷程度，通過熒光探針標(biāo)記法檢測細(xì)胞OGD/Rep及給藥處理后線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示，細(xì)胞在給予OGD/Rep處理后線粒體膜電位降低，ROS水平升高，即發(fā)生氧化損傷，且MT-/-細(xì)胞損傷程度較MT+/+細(xì)胞更嚴(yán)重；加入保護(hù)性藥物白藜蘆醇后，細(xì)胞的損傷有所改善，且對MT+/+細(xì)胞保護(hù)更明顯。 氧化損傷產(chǎn)生的ROS最先由SOD轉(zhuǎn)化清除，兩種細(xì)胞再灌注不同時(shí)間（2h,6h,12h,24h）后，測定MT-I/II和重要抗氧化物Mn-SOD的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，對MT+/+細(xì)胞給予OGD/Rep處理后MT-I/II在Rep24h時(shí)MT-I/II表達(dá)都顯著上升，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞中MT-I/II在Rep12-24h間表達(dá)上調(diào)并發(fā)揮作用。將MT+/+與MT-/-兩種細(xì)胞再灌注過程SOD表達(dá)進(jìn)行比較可得出，MT+/+細(xì)胞OGD/Rep處理后Mn-SOD mRNA也在Rep24h時(shí)表達(dá)突然上升，這與MT-I/II的表達(dá)變化時(shí)間一致。MT-/-細(xì)胞在發(fā)生OGD后SOD表達(dá)減少，在Rep6h時(shí)表達(dá)上調(diào)并隨著Rep時(shí)間加長表達(dá)逐漸下降，這兩種細(xì)胞SOD的表達(dá)有明顯的差異性，MT-/-細(xì)胞可能由于缺失了MT這一重要抗氧化蛋白，在受到氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞通過調(diào)節(jié)SOD等抗氧化物表達(dá)來達(dá)到自身保護(hù)作用。加入保護(hù)性藥物白藜蘆醇，MT-I/II mRNA在Rep6h時(shí)兩者都表達(dá)上調(diào)，跟未加白藜蘆醇組相比（在Rep24h顯著上升），MT上調(diào)的時(shí)間提前了18h。MT+/+星形膠質(zhì)細(xì)胞在Rep6h時(shí)表達(dá)上升，與未加藥組相比（上升時(shí)間點(diǎn)為Rep24h），SOD上調(diào)的時(shí)間提前了18h，且其趨勢與MT表達(dá)變化相似； MT-/-細(xì)胞在OGD后SOD水平立即下降至極低，在Rep2h時(shí)恢復(fù)至正常水平，與未加藥組相比（Rep6h表達(dá)升高），SOD上調(diào)的時(shí)間提前了4h。從這些結(jié)果可得出白藜蘆醇能調(diào)節(jié)MT-I/II和SOD的表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)作用，白藜蘆醇對MT+/+細(xì)胞SOD的調(diào)節(jié)水平較MT-/-更明顯，也提示了白藜蘆醇調(diào)節(jié)MT-I/II可能是抗氧化應(yīng)激作用的作用機(jī)制。 結(jié)論：綜上所述，本課題應(yīng)用MT-I/II基因敲除小鼠和野生型小鼠分別建立原代培養(yǎng)的新生小鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞模型，并通過細(xì)胞胞氧糖剝奪培養(yǎng)和再復(fù)糖復(fù)氧建立了體外模擬缺血再灌注模型。應(yīng)用這些模型證實(shí)了MT-I/II對OGD/Rep誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，提示其作用機(jī)制與保護(hù)細(xì)胞抗氧化酶MnSOD密切相關(guān)；同時(shí)證實(shí)白藜蘆醇有可能通過調(diào)節(jié)MT-I/II的表達(dá)以發(fā)揮其抗腦缺血損傷作用。
【關(guān)鍵詞】：金屬硫蛋白 氧糖剝奪再灌注 星形膠質(zhì)細(xì)胞 損傷 白藜蘆醇
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-24
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-40
• 討論40-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 文獻(xiàn)綜述47-56
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 個(gè)人簡歷56-57
• 致謝57

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本文編號：482507