本文關(guān)鍵詞：致倦庫蚊被武昌羅索線蟲感染后免疫基因差異表達(dá)及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蚊類是多種病原體和寄生蟲的傳播媒介,能引起瘧疾、登革熱和淋巴絲蟲病等嚴(yán)重傳染性疾病,屬于重要的公共衛(wèi)生害蟲。武昌羅索線蟲(Romanomermis wuchangensis)可感染并殺死十余種庫蚊及伊蚊幼蟲,是一種很有發(fā)展前景的生物滅蚊劑。其感染庫蚊后可引發(fā)宿主體內(nèi)包括模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)在內(nèi)的多種分子參與的一系列的免疫反應(yīng)。昆蟲通過PRRs識(shí)別和結(jié)合病原物的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecule patterns, PAMPs)來啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)。C型凝集素(C-type lectins, CTLs)作為一種重要的模式識(shí)別受體,在病原的識(shí)別和清除方面發(fā)揮著多種功能并扮演著重要角色。本研究對(duì)致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)被武昌羅索線蟲感染后的存活率進(jìn)行了分析；并通過熒光定量的方法分析了致倦庫蚊被武昌羅索線蟲感染后不同時(shí)期模式識(shí)別受體基因CTL12 (C-type lectin 12)、 PGRPLC (Peptidoglycan recognition protein LC)、 PGRPLE (Peptidoglycan recognition protein LE)、PGRPS1 (Peptidoglycan recognition protein S1)、 PGRPS6 (Peptidoglycan recognition protein S6), TOLL信號(hào)通路基因TOLL9A、CACT(Cactus), IMD(Immune deficiency)信號(hào)通路基因IMD (Immune deficiency) 、REL1A (Relish 1A), JAK/STAT (Janus kinase/signal transducer and activator transcription)信號(hào)通路基因DOME(Domeless)、 HOP (Hopscotch)、 STAT1A (Signal transducer and activator of transcription 1A),凝結(jié)黑化途徑基因SRPN6 (Serine proteinase inhibitor 6)、CLIPC2 (Clip-domain serine protease C2),免疫效應(yīng)分子基因PPO2 (Prophenoloxidase 2)、PPO5 (Prophenoloxidase 5)、CECA2 (Cecropin 2),自噬途徑基因ATG5 (Autophagy-related protein 5)、ATG8 (Autophagy-related protein 8)等19個(gè)免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況；篩選出顯著下調(diào)表達(dá)的免疫基因CTL12,并對(duì)其進(jìn)行了蛋白原核表達(dá)和體外功能實(shí)驗(yàn),初步探究了致倦庫蚊CqCTL12基因在其抵御細(xì)菌和線蟲感染的免疫反應(yīng)中的功能和作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1.致倦庫蚊被武昌羅索線蟲感染后的存活率分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6天后感染組孑(?)的存活率極顯著低于對(duì)照組(p.001),表明武昌羅索線蟲對(duì)致倦庫蚊具有較高的致死率。2.致倦庫蚊被線蟲感染后不同時(shí)期免疫基因的表達(dá)水平分析。結(jié)果表明:CTL12和PGRPLC在線蟲寄生的初期(2天、4天)呈顯著性下調(diào)表達(dá)(p0.05),推測(cè)其可能在庫蚊抵御線蟲入侵的過程中起著關(guān)鍵作用；而ATG5和ATG8在線蟲寄生的晚期(6天)呈顯著性上調(diào)表達(dá)(p0.05),推測(cè)在線蟲寄生的后期庫蚊體內(nèi)可能出現(xiàn)了大量自噬現(xiàn)象。3. CqCTL12和CqATG8基因的序列分析。結(jié)果顯示：CqCTL12基因包含486個(gè)核苷酸序列,編碼162個(gè)氨基酸,蛋白分子量約為16.04kDa,含有典型的CRD結(jié)構(gòu)域,其CRD結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)保守的半胱氨酸和1個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn),在Ca2+結(jié)合位點(diǎn)中含有一個(gè)可結(jié)合半乳糖的QLD基序和一個(gè)與Ca2+依賴活性相關(guān)的WND基序；CqATG8長(zhǎng)為357bp,編碼118個(gè)氨基酸,蛋白分子量為14.056kDa。4.原核表達(dá)純化獲得重組蛋白rCqCTL12和rCqATG8。 rCqCTL12對(duì)細(xì)菌的凝集實(shí)驗(yàn)表明：rCqCTL12能顯著凝集革蘭氏陰性菌Escherichia coli和革蘭氏陽性菌Staphylococcus aureus,具有典型的Ca2+依賴效應(yīng)。5. rCqCTL12與武昌羅索線蟲感染期幼蟲的體外結(jié)合。實(shí)驗(yàn)表明：rCqCTL12能在體外與甲醛殺死的及活體狀態(tài)下的感染期幼線蟲結(jié)合,且這種結(jié)合與Ca2+存在與否無關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,包括CqCTL12在內(nèi)的致倦庫蚊多種免疫基因在抵御線蟲和細(xì)菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用。研究結(jié)果為后續(xù)武昌羅索線蟲在衛(wèi)生害蟲蚊類的生物防控上的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)性資料。
【關(guān)鍵詞】：武昌羅索線蟲 致倦庫蚊 熒光定量 C型凝集素 CqCTL12 CqATG8 細(xì)菌凝集 線蟲結(jié)合
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R184.3
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 1 前言12-26
• 1.1 武昌羅索線蟲的研究概況12-13
• 1.2 武昌羅索線蟲主要宿主13-14
• 1.2.1 致倦庫蚊13
• 1.2.2 埃及伊蚊和白紋伊蚊13-14
• 1.3 昆蟲免疫機(jī)制14-20
• 1.3.1 體液免疫14-19
• 1.3.2 細(xì)胞免疫19
• 1.3.3 自噬途徑19-20
• 1.4 模式識(shí)別受體20-22
• 1.5 C型凝集素22-24
• 1.5.1 CTLs的結(jié)構(gòu)特征22
• 1.5.2 CTLs在昆蟲中的研究概況22-24
• 1.6 本研究的目的和意義24-26
• 2 材料與方法26-41
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-29
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的獲取26
• 2.1.2 主要菌株與載體26
• 2.1.3 主要試劑與藥品26-27
• 2.1.4 主要儀器與設(shè)備27
• 2.1.5 引物序列27-28
• 2.1.6 常用溶液配制28-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-41
• 2.2.1 致倦庫蚊被武昌羅索線感染蟲后的存活率分析29-30
• 2.2.2 庫蚊總RNA的提取30
• 2.2.3 總RNA中基因組DNA的消化和反轉(zhuǎn)錄30-31
• 2.2.4 致倦庫蚊被線蟲感染后不同時(shí)期免疫基因的表達(dá)水平31-32
• 2.2.5 CqCTL12和CqATG8基因的克隆32-34
• 2.2.6 重組蛋白rCqCTL12和rCqATG8的原核表達(dá)與純化34-39
• 2.2.7 rCqCTL12對(duì)細(xì)菌的體外凝集39
• 2.2.8 rCqCTL12與武昌羅索線蟲感染期幼蟲的體外結(jié)合39-41
• 3 結(jié)果與分析41-64
• 3.1 致倦庫蚊被武昌羅索線蟲感染后的存活率分析41-42
• 3.2 致倦庫蚊總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄42-43
• 3.3 致倦庫蚊被線蟲感染后不同時(shí)期免疫基因的表達(dá)水平43-52
• 3.3.1 模式識(shí)別受體43-45
• 3.3.2 Toll信號(hào)通路45-46
• 3.3.3 IMD信號(hào)通路46-47
• 3.3.4 JAK/STAT信號(hào)通路47-49
• 3.3.5 凝結(jié)黑化途徑49-50
• 3.3.6 免疫效應(yīng)分子50-51
• 3.3.7 自噬途徑51-52
• 3.4 CqCTL12和CqATG8基因的克隆52-56
• 3.4.1 CqCTL12和CqATG8基因的擴(kuò)增52-53
• 3.4.2 CqCTL12和CqATG8基因克隆載體的構(gòu)建和陽性檢測(cè)53
• 3.4.3 CqCTL12和CqATG8基因的序列分析53-56
• 3.5 重組蛋白rCqCTL12和rCqATG8的原核表達(dá)與純化56-59
• 3.5.1 CqCTL12和CqATG8基因成熟肽編碼區(qū)的擴(kuò)增和雙酶切56-57
• 3.5.2 PET32a空載質(zhì)粒的提取和雙酶切57
• 3.5.3 表達(dá)載體的構(gòu)建、陽性檢測(cè)和雙酶切驗(yàn)證57-58
• 3.5.4 重組蛋白rCqCTL12和rCqATG8的表達(dá)和純化58-59
• 3.6 rCqCTL12對(duì)細(xì)菌的體外凝集59-61
• 3.7 rCqCTL12與武昌羅索線蟲感染期幼蟲的體外結(jié)合61-64
• 4 討論64-67
• 5 小結(jié)與展望67-68
• 參考文獻(xiàn)68-78
• 碩士期間發(fā)表的論文78-79
• 致謝79

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：致倦庫蚊被武昌羅索線蟲感染后免疫基因差異表達(dá)及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：435126