本文關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸酯對秀麗隱桿線蟲的雌性生殖毒性，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和研究目的鄰苯二甲酸酯(PAEs)作為聚氯乙烯塑料的增塑劑,在塑料生產(chǎn)和生活使用過程中釋放進入環(huán)境,在多種環(huán)境介質(zhì)中均能檢出,作為一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,其對水生生物和藻類的繁殖和生長發(fā)育都造成了不同程度的影響。本研究利用秀麗隱桿線蟲研究PAEs的雌性生殖毒性,尋找評價PAEs生殖毒性的敏感指標(biāo),探討PAEs對卵子發(fā)生過程的損傷作用,探討其發(fā)揮生殖毒性作用的機制。方法和結(jié)果一. PAEs對秀麗隱桿線蟲的生殖毒性作用1.PAEs對秀麗隱桿線蟲繁殖力的影響測定PAEs對線蟲的急性毒性,每個試驗暴露組選擇同步化L4期后24h的N2線蟲,設(shè)五個染毒劑量組(100、10、1、0.1、0.01mg/L)、溶劑對照組和空白對照組,24孔板染毒暴露24h,染毒結(jié)束后觀測各個組線蟲死亡數(shù),計算PAEs對線蟲的LCso。試驗結(jié)果顯示PAEs的LCso遠高于100 mg/L,各個劑量組線蟲死亡數(shù)與溶劑對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異；應(yīng)用后代數(shù)目和世代時間評價PAEs對線蟲生育力的影響,每個試驗暴露組選擇同步化L4期后24h的N2線蟲,設(shè)三個染毒劑量(10、1、0.1mg/L)、溶劑對照組和空白對照組,24孔板染毒暴露24h,染毒結(jié)束后計數(shù)線蟲后代數(shù)目和測定線蟲世代時間。結(jié)果顯示僅DEHP的高劑量染毒組的后代數(shù)目與溶劑對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異的減少,其他染毒物的各個劑量組均未出現(xiàn)明顯變化；PAEs的各個染毒劑量暴露后,世代時間均末出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異的延長或縮短。2. PAEs對秀麗隱桿線蟲卵子發(fā)生的影響應(yīng)用生殖細胞數(shù)目評價PAEs對線蟲卵子發(fā)生的影響,每個試驗暴露組選擇同步化L4期后24h的N2線蟲,染毒劑量和暴露方式同上,染毒結(jié)束后DAPI染色。結(jié)果顯示,DEHP、DBP和DIBP的中高劑量組的生殖細胞數(shù)與溶劑對照組比較均出現(xiàn)了有統(tǒng)計學(xué)差異的減少,各個染毒物低劑量組均未出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異的改變；JK2868突變株(Plag-2::GFP)的性腺DTC細胞熒光強度反映性腺結(jié)構(gòu)是否正常,每個試驗暴露組為同步化L4期后24h的JK2868突變株線蟲,染毒劑量和暴露方式同上,染毒結(jié)束后檢測DTC細胞熒光強度,熒光分析結(jié)果提示PAEs染毒暴露后DTC熒光強度未發(fā)生改變,提示PAEs不通過影響性腺結(jié)構(gòu)來發(fā)揮生殖毒作用。二、PAEs影響秀麗隱桿線蟲卵子發(fā)生的作用機制1.PAEs對秀麗隱桿線蟲生殖細胞凋亡影響計數(shù)凋亡的生殖細胞數(shù)反映PAEs對線蟲凋亡的影響,每個試驗暴露組MD701突變株(Plim-7::ced-1::gfp)線蟲的染毒劑量和暴露方式同上,染毒結(jié)束后,熒光顯微鏡下檢測線蟲生殖細胞的凋亡數(shù),試驗結(jié)果顯示PAEs使線蟲凋亡水平上升,各個毒物的中高劑量組凋亡細胞數(shù)與溶劑對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異；WS1433突變株(HUS-1::GFP)指示線蟲生殖細胞DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡,每個試驗暴露組選擇同步化L4期后24h的WS1433突變株線蟲,染毒劑量和暴露方式同上,染毒結(jié)束后,在熒光顯微鏡下顯示PAEs高劑量染毒組中,線蟲生殖細胞DNA修復(fù)指示熒光明顯增強,提示PAEs暴露后線蟲生殖細胞出現(xiàn)DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡。2. PAEs對秀麗隱桿線蟲生殖細胞凋亡作用機制研究檢測凋亡相關(guān)基因的表達水平,反映其在凋亡通路中的作用,每個試驗暴露組選擇80-100μL同步化L4期后24h的N2線蟲,染毒劑量和暴露方式同上,染毒結(jié)束后提取線蟲總RNA, RT-qPCR檢測線蟲組織中凋亡發(fā)生相關(guān)基因egl-1、cep-1、ced-9、ced-4和ced-3基因的表達水平,結(jié)果顯示egl-1、cep-1、ced-4和ced-3基因表達水平明顯升高,ced-9基因表達水平顯著下降；應(yīng)用凋亡基因突變株驗證凋亡基因在通路中的作用,凋亡相關(guān)基因egl-1、cep-1、ced-9、ced-4和ced-3敲除突變株染毒劑量和暴露方式同上,染毒結(jié)束后測定PAEs染毒暴露后生殖細胞凋亡數(shù)目,試驗結(jié)果顯示egl-1、cep-1、ced-4和 ced-3突變株染毒后凋亡數(shù)目明顯下降,ced-9突變株染毒后凋亡數(shù)目明顯增加。三PAEs對秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激的影響1.PAEs對秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激的影響測定線蟲體內(nèi)ROS反映線蟲氧化應(yīng)激水平,CM-H2DCFDA探針指示線蟲體內(nèi)產(chǎn)生的ROS,每個試驗暴露組選擇同步化L4期后24h的N2線蟲,染毒劑量和暴露方式同上,染毒結(jié)束后,用CM-H2DCFDA探針測定線蟲體內(nèi)ROS水平,熒光顯微鏡下探針結(jié)果顯示,PAEs的中高劑量組線蟲體內(nèi)ROS水平均上升；測定ROS中主要成分H2O2水平,每個試驗暴露組選擇80-100μL同步化L4期后24h的N2線蟲,染毒劑量和暴露方式同上,染毒結(jié)束后研磨線蟲,測定線蟲體內(nèi)H2O2水平,試驗結(jié)果顯示各個劑量組H2O2水平無差異性改變。2. PAEs對秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激機制研究檢測氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達水平,反映其在氧化應(yīng)激通路中的作用,每個試驗暴露組選擇80-100μL同步化L4期后24h的N2線蟲,染毒劑量和暴露方式同上,染毒結(jié)束后提取線蟲總RNA, RT-qPCR檢測線蟲組織中凋亡發(fā)生相關(guān)基因mev-1、gas-1、isp-1、clk-2基因的表達水平,結(jié)果顯示isp-1、clk-2基因表達水平明顯升高,mev-1、gas-1基因表達水平顯著下降。3. PAEs對秀麗隱桿線蟲生殖細胞DNA損傷研究應(yīng)用線蟲DNAAP位點數(shù)反映DNA損傷情況,每個試驗暴露組選擇80-100μL同步化L4期后24h的N2線蟲,染毒劑量和暴露方式同上,染毒結(jié)束后提取線蟲DNA,測定線蟲DNAAP位點數(shù),結(jié)果顯示PAEs的不同染毒暴露組的AP位點數(shù)隨染毒劑量增加而增加,DEHP的中高劑量組以及DBP、DIBP各個劑量組與溶劑對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論PAEs屬于低毒性物質(zhì),后代數(shù)目和世代時間不是評價PAEs對秀麗隱桿線蟲生殖毒性的敏感指標(biāo),染毒暴露后卵子數(shù)目的改變相對后代數(shù)目和世代時間更敏感。PAEs通過誘導(dǎo)線蟲體內(nèi)ROS水平增加、產(chǎn)生AP位點數(shù)增加的DNA損傷,出現(xiàn)DNA損傷誘導(dǎo)的生殖細胞凋亡及生殖細胞數(shù)減少而產(chǎn)生生殖毒性作用。
【關(guān)鍵詞】：鄰苯二甲酸酯 秀麗線蟲 雌性生殖毒性 后代數(shù)目 世代時間 凋亡 DNA損傷
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 縮略詞表9-11
• 前言11-13
• 第一章 PAEs對秀麗隱桿線蟲的生殖毒性作用13-23
• 第一節(jié) PAEs對秀麗隱桿線蟲繁殖力的影響13-18
• 1 材料與方法13-15
• 2 結(jié)果15-16
• 3 討論16-18
• 第二節(jié) PAEs對秀麗隱桿線蟲卵子發(fā)生的影響18-23
• 1 材料與方法18-19
• 2 結(jié)果19-21
• 3 討論21-23
• 第二章 PAEs影響秀麗隱桿線蟲卵子發(fā)生的作用機制23-35
• 第一節(jié) PAEs對秀麗隱桿線蟲生殖細胞凋亡影響23-28
• 1 材料與方法23-24
• 2. 結(jié)果24-26
• 3 討論26-28
• 第二節(jié) PAEs對秀麗隱桿線蟲生殖細胞凋亡作用機制研究28-35
• 1 材料與方法28-30
• 2 結(jié)果30-33
• 3 討論33-35
• 第三章 PAEs對秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激的影響35-45
• 第一節(jié) PAEs對秀麗隱桿線蟲ROS的影響35-39
• 1 材料與方法35-36
• 2 結(jié)果36-38
• 3 討論38-39
• 第二節(jié) PAEs對秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激研究39-43
• 1 材料與方法39-40
• 2 結(jié)果40-42
• 3 討論42-43
• 第三節(jié) PAEs對秀麗隱桿線蟲生殖細胞DNA損傷研究43-45
• 1 材料與方法43-44
• 2 結(jié)果44
• 3 討論44-45
• 總結(jié)45-46
• 參考文獻46-51
• 綜述51-57
• 參考文獻55-57
• 致謝57-58
• 作者簡介58

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1 ;寄生蟲發(fā)育的一種獨特方式[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年08期

2 周雪;王娟;陳秀華;;秀麗隱桿線蟲在抗腫瘤藥物開發(fā)中的應(yīng)用[J];世界臨床藥物;2013年03期

3 屈長青;徐林麗;陸娟;姬云濤;;羅勒水提物對秀麗隱桿線蟲脂肪沉積的影響[J];中國生化藥物雜志;2012年02期

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本文編號：415201