本文關(guān)鍵詞：沉默Keap1基因?qū)腔嚓P(guān)基因和砷代謝相關(guān)指標的影響及在砷皮膚角化異常中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:以慢病毒介導的Keap1基因沉默的人角質(zhì)形成細胞株Ha Ca T細胞為模型細胞,研究Nrf2對角化相關(guān)基因和砷代謝相關(guān)指標的影響及在砷致皮膚毒性中作用,為砷致皮膚毒性機制提供理論依據(jù)。方法:1.Keap1 shRNA的構(gòu)建:利用RNAi技術(shù),以人Keap1基因為靶基因,設(shè)計Keap1基因特異性的小干擾RNA,構(gòu)建其shRNA,重組慢病毒表達載體,并進行測序鑒定。2.慢病毒包裝:用重組成功的表達載體轉(zhuǎn)染包裝細胞293T,收集、濃縮病毒上清液、測定其滴度;3.Keap1沉默Hacat細胞模型的構(gòu)建,構(gòu)建好的三種慢病毒分別感染HaCaT細胞(MOI=5),感染48小時后,用1ug/ml的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細胞株。4.穩(wěn)定細胞株的鑒定:篩選出穩(wěn)定的細胞株,用實時熒光定量(Real-Time Quantitative PCR)檢測干擾效率。5.細胞培養(yǎng)與染毒:模型細胞與正常細胞按細胞常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)。6.MTT法檢測細胞生長狀況,確定染毒濃度,染毒濃度別為LC50的1/100、1/50、1/10。7.流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況:參照相關(guān)試劑盒說明書。8.實時熒光定量PCR檢測細胞中Nrf2、K1、K10、INV、LOR、NF-кB、N6AMT1 mRNA的表達水平。9.ELISA法檢測細胞中COX-2、N6AMT1、SAM、HCY的蛋白表達水平。結(jié)果:1.慢病毒干擾載體構(gòu)建測序結(jié)果顯示重組載體構(gòu)建成功。2.慢病毒滴度測試結(jié)果:依據(jù)滴度(TU/ml)=細胞數(shù)×百分比×MOI(1)×病毒稀釋倍數(shù)×10^3選取最佳滴度的病毒。3.選取Keap1 shRNA1 Hacat細胞,其基因的沉默效率為71%。4.混合砷液染毒2.90μmol/L、5.80μmol/L、29.00μmol/L,分別為低、中、高劑量組,陰性對照組和空白對照組染毒濃度為0μmol/L。5.細胞增殖:2.90μmol/L混合砷液染毒細胞,細胞明顯增殖;5.80μmol/L混合砷液染毒細胞72h開始出現(xiàn)明顯抑制;29.00μmol/L混合砷液染毒細胞48h開始明顯抑制細胞增殖�？瞻讓φ占毎鲋德事缘陀�0μmol/L染毒組。6.細胞凋亡:2.90μmol/L染毒時,各時間段細胞凋亡率均低于正常對照組,提示2.90μmol/L混合砷液染毒細胞,在促進細胞增殖同時,誘導細胞凋亡率降低;5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒組隨著染毒劑量的增加,細胞凋亡率也逐漸增加。7.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細胞8h、24h后能促進Nrf2、K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA的表達上調(diào);29.00μmol/L的混合砷染毒72h可使Keap1沉默細胞中Nrf2、K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。8.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細胞能促進N6AMT1、COX-2、SAM、HCY蛋白的表達;29.00μmol/L混合砷染毒Keap1沉默細胞N6AMT1、SAM、HCY蛋白的表達量下降差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);29.00μmol/L COX-2蛋白的表達量仍遠于對照組且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:1.細胞增殖:2.90μmol/L混合砷液染毒細胞,細胞明顯增殖;5.80μmol/L混合砷液染毒細胞72h開始出現(xiàn)明顯抑制;29.00μmol/L混合砷液染毒細胞48h開始明顯抑制細胞增殖。空白對照細胞增值率略低于0μmol/L染毒組,提示沉默Keap1基因后Nrf2高表達有利于細胞的增殖,混合砷液對細胞的增殖影響具有時間-劑量依賴性。細胞凋亡:2.90μmol/L混合砷液染毒細胞,在促進細胞增殖同時,誘導細胞凋亡率降低;5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒組隨著染毒劑量的增加,細胞凋亡率也逐漸增加;隨著染毒時間的延長,細胞的凋亡率也上升,提示混合砷液誘導細胞凋亡具有一定的時間-劑量依賴性。2.混合砷染毒Keap1沉默Ha Ca T細胞,Nrf2處于高表達狀態(tài),隨著染毒時間延長、染毒濃度增加基因有下調(diào)趨勢,但明顯高于未轉(zhuǎn)染組。3.混合砷染毒能使Keap1沉默Ha Ca T細胞中K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表達發(fā)生改變,隨著染毒時間延長、染毒濃度增加能使基因表達逐漸下調(diào)。4.Keap1沉默Ha Ca T細胞染毒后在8h、24h檢測到LORmRNA表達為陰性,2.90μmol/L、5.80μmol/L染毒組在72h檢測到LOR mRNA上調(diào),29.00μmol/L組在48h、72h檢測到LOR mRNA上調(diào)。5.混合砷染毒能使Keap1沉默Ha Ca T細胞中N6AMT1、COX-2、SAM、HCY蛋白表達發(fā)生改變:隨著染毒時間延長、染毒濃度增加表達量逐漸下降。6.混合砷液對Keap1沉默HaCa T細胞的毒性作用受時間和濃度交互作用的影響,可推測砷暴露隨著染毒時間的延長,染毒濃度的加大對皮膚細胞的損害越嚴重。
【關(guān)鍵詞】：Ha Ca T細胞 細胞活性 基因表達 慢病毒 Real-time PCR ELISA
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表5-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-31
• 1 實驗材料15-19
• 2 實驗方法19-30
• 3. 統(tǒng)計分析30
• 4. 質(zhì)量控制30-31
• 結(jié)果31-58
• 討論58-64
• 小結(jié)64-65
• 致謝65-66
• 參考文獻66-72
• 綜述72-82
• 參考文獻77-82
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學位論文82-83
• 導師評閱表83

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