本文關(guān)鍵詞：低劑量BaP、鋁聯(lián)合染毒對原代大鼠神經(jīng)細胞凋亡的協(xié)同作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】通過研究鋁、苯并[a]芘聯(lián)合染毒對大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響，探索兩種毒物共同作用下致神經(jīng)細胞凋亡的機制。 【方法】 1.原代皮質(zhì)神經(jīng)細胞培養(yǎng)：采用出生1～3d的SD大鼠并在無菌條件下取出大腦皮質(zhì)，用0.25%胰酶消化后接種神經(jīng)細胞。細胞培養(yǎng)5d后，選取生長良好的同批次細胞，分為：對照組、溶劑對照組(DMSO+S9+maltol)、單獨染BaP組(10μmol/L BaP)、單獨染鋁組(50μmol/LAl(mal)3)、聯(lián)合染毒組(50μmol/LAl(mal)3+10μmol/L BaP)，繼續(xù)培養(yǎng)72h后處理細胞。 2.神經(jīng)細胞基本形態(tài)學變化：①光學顯微鏡下觀察不同實驗組神經(jīng)細胞凋亡的形態(tài)學變化；②透射電鏡下觀察不同實驗組神經(jīng)細胞凋亡的形態(tài)學變化；③熒光顯微鏡下觀察，神經(jīng)細胞凋亡情況（AO-EB熒光染色法）； 3.細胞凋亡相關(guān)指標的檢測方法：①細胞活力測定（采用CCK8法）；②Annexin-V和PI雙染法測定細胞的凋亡率；③caspase酶活性試劑盒檢測caspase-8，-9，-3的活性趨勢；④RT-PCR法檢測細胞凋亡相關(guān)基因caspase-8，-9，-3的表達。 【結(jié)果】 1.細胞活力檢測結(jié)果:細胞染毒72h后，單獨染BaP組(40μM)、單獨染鋁組(100μM、400μM)及所有聯(lián)合染毒組的細胞活力明顯降低(P＜0.05)，分別下降了10.81%、10.18%、18.75%、22.93%、25.99%、33.44%、29.38%、43.77%、51.25%；而溶劑對照組、染10μM BaP組和染50μMAl(mal)3組的細胞活力與對照組相比沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)，說明10μM的BaP或50μM的Al(mal)3具有弱毒性。析因分析結(jié)果表明，BaP與鋁聯(lián)合染毒致原代培養(yǎng)大鼠的神經(jīng)細胞活力降低具有交互作用(F=21.491，P0.001)。其交互作用的均值圖的曲線隨著染毒劑量增大而相互遠離，即交互作用為協(xié)同作用。 2.染毒后的形態(tài)學改變： ①光鏡下，染10μM BaP組和染50μMAl(mal)3組變化不明顯；聯(lián)合染毒組出現(xiàn)神經(jīng)細胞的數(shù)目減少、細胞胞體體積收縮、變圓，軸突縮短的現(xiàn)象。 ②透射電鏡下，可以看到染10μM BaP組、染50μMAl(mal)3組神經(jīng)元細胞出現(xiàn)輕微核膜皺縮，胞質(zhì)致密，核染色質(zhì)邊集等細胞凋亡的經(jīng)典形態(tài)學變化；聯(lián)合染毒組出現(xiàn)了細胞核裂解甚至凋亡小體。 ③熒光顯微鏡下，對照組細胞呈AO染色的亮綠色，顯示了完整的細胞膜和均勻的細胞質(zhì)；染10μM BaP組、染50μM Al(mal)3組細胞呈現(xiàn)出少量的AO-EB共同染色的桔色凋亡細胞；聯(lián)合染毒組AO-EB共同染色的桔色凋亡細胞數(shù)目明顯增多。 3.細胞凋亡相關(guān)指標檢測結(jié)果： ①Annexin-V和PI雙染法測定細胞凋亡率結(jié)果顯示，與對照組相比，染10μM BaP組總凋亡率差別沒有統(tǒng)計學意義（P0.05）；染50μM Al(mal)3組和聯(lián)合染毒組總凋亡率差別均有明顯統(tǒng)計學意義（P0.05）。析因分析結(jié)果表明，BaP與鋁聯(lián)合染毒致原代培養(yǎng)大鼠的神經(jīng)細胞降低凋亡率具有交互作用并表現(xiàn)為協(xié)同作用，提示二者共同作用時可使細胞損傷程度增強。各實驗組分別加入了caspase-8抑制劑(C8-I)，caspase-9抑制劑(C9-I)后，結(jié)果顯示，與染10μM BaP組比較，C8-I+10μM BaP組的原代神經(jīng)細胞凋亡率差別沒有統(tǒng)計學意義（P0.05），C9-I+10μM BaP組的原代神經(jīng)細胞凋亡率差別有統(tǒng)計學意義（P0.05）；與染50μM Al(mal)3組比較，C8-I+50μM Al(mal)3組和C9-I+50μM Al(mal)3組原代神經(jīng)細胞凋亡率差別均有統(tǒng)計學意義（P0.05）；與聯(lián)合染毒組比較，C8-I+聯(lián)合染毒組和C9-I+聯(lián)合染毒組的原代神經(jīng)細胞凋亡率差別有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 ②caspase酶活性試劑盒檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，各實驗組的原代神經(jīng)細胞中caspase-3，caspase-9酶活性均明顯升高，差別有統(tǒng)計學意義（P0.05）；50μM Al(mal)3組和聯(lián)合染毒組的原代神經(jīng)細胞中caspase-8酶活性明顯升高，差別有統(tǒng)計學意義（P0.05）。并經(jīng)析因分析所得，在鋁與BaP聯(lián)合染毒所致原代神經(jīng)細胞中caspase-8，caspase-9，caspase-3酶活性上存在交互作用，其交互作用類型為協(xié)同作用。加C8-I或C9-I抑制劑前后比較發(fā)現(xiàn)，caspase-8對10μM BaP致原代神經(jīng)細胞凋亡的作用中生成的效應(yīng)分子caspase-3活性未起到明顯作用（P0.05），對50μMAl(mal)3和兩者聯(lián)合染毒組的原代神經(jīng)細胞中生成的凋亡效應(yīng)分子caspase-3活性起到一定作用（P0.05）。Caspase-9對染10μM BaP、染50μM Al(mal)3和兩者聯(lián)合染毒組的caspase-3活性均起到明顯作用（P0.05）。 ③RT-PCR法檢測細胞凋亡相關(guān)基因caspase-8，caspase-9，caspase-3的表達。與對照組相比，各實驗組中caspase-3，caspase-9基因表達量明顯升高，差別均有統(tǒng)計學意義（P0.05）；染10μM BaP組中caspase-8基因表達量升高，但差別沒有統(tǒng)計學意義（P0.05），染50μMAl(mal)3和聯(lián)合染毒組中caspase-8基因表達量升高，，差別均有統(tǒng)計學意義（P0.05）。在caspase-8，caspase-9，caspase-3基因表達水平上，BaP和鋁兩者存在交互作用（P0.001），并表現(xiàn)為協(xié)同作用。加C8-I和C9-I抑制劑前后比較，caspase-8對染10μM BaP組中caspase-3基因未起到明顯作用（P0.05），對染50μMAl(mal)3組和兩者聯(lián)合染毒組中caspase-3基因水平起到明顯作用（P＜0.05）；caspase-9對所有實驗組中caspase-3基因表達水平均起到明顯作用（P＜0.05）。 【結(jié)論】 1.鋁和BaP聯(lián)合作用可使大鼠神經(jīng)細胞的活力降低，并出現(xiàn)一定劑量效應(yīng)關(guān)系； 2.鋁和BaP聯(lián)合作用使神經(jīng)細胞凋亡率大大增加，初步提示兩者的聯(lián)合作用類型為協(xié)同作用，即兩者的聯(lián)合作用大大增強神經(jīng)毒性效應(yīng)。 3.鋁和BaP聯(lián)合作用是通過增強caspase-8和caspase-9的水平從而影響caspase-3水平，最終導致細胞凋亡，加強了神經(jīng)細胞損傷的程度。4.鋁和BaP兩者的聯(lián)合作用致神經(jīng)細胞凋亡過程中激發(fā)了caspase-8為代表的死亡受體通 路和caspase-9為代表的線粒體通路，最終導致caspase-3的活性升高，細胞凋亡率上升，這可能是兩者交互作用于神經(jīng)細胞產(chǎn)生協(xié)同作用的機制之一。
【關(guān)鍵詞】：鋁 苯并[a]芘 協(xié)同作用 神經(jīng)細胞 凋亡
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R135.1
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-21
• 結(jié)果21-37
• 總結(jié)37-38
• 討論38-42
• 綜述42-47
• 參考文獻47-55
• 致謝55-56
• 個人簡歷56

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