研究目的蜱蟲是僅次于蚊類的第二大類媒介節(jié)肢動(dòng)物,具有生命周期長(zhǎng),分布廣泛,宿主可選擇范圍大等特點(diǎn)。經(jīng)蜱蟲可以傳播細(xì)菌、病毒、螺旋體、立克次體、原生動(dòng)物和寄生蟲等病原微生物,其中不乏對(duì)人類和動(dòng)物具有高度致病性的病原體。隨著深度測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,將蜱蟲病毒組學(xué)研究和高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合,豐富了人們對(duì)于蜱蟲攜帶病毒多樣性的認(rèn)知,發(fā)現(xiàn)了許多與已知病毒存在巨大差異的新型病毒。為深入了解浙江舟山地區(qū)蜱蟲攜帶病毒譜的情況,本課題選擇浙江舟山群島的衢山島、舟山島和岱山島三個(gè)島嶼,作為蜱蟲采集點(diǎn),進(jìn)行蜱蟲采集和高通量測(cè)序,并對(duì)測(cè)序發(fā)現(xiàn)的病毒譜進(jìn)行了進(jìn)一步研究。研究方法和結(jié)果1.標(biāo)本采集及宏基因組測(cè)序采集上述三地蜱蟲共計(jì)421只,蜱蟲種類經(jīng)形態(tài)學(xué)初步分類后,針對(duì)蜱蟲線粒體16s核糖體RNA設(shè)計(jì)特異性引物,PCR鑒定為長(zhǎng)角血蜱Haemaphysalis longicornis和鐮形扇頭蜱Rhipicephalus haemaphysaloides。選取三個(gè)采集地點(diǎn)各20只蜱蟲進(jìn)行高通量測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行整理,結(jié)果共計(jì)獲得23,915,810條讀長(zhǎng)(reads),經(jīng)拼接后有10,106,532條reads...

【文章頁(yè)數(shù)】：81 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
中英文縮略語(yǔ)索引
第一章 前言
    1.1 概述
    1.2 蜱蟲的種類
    1.3 蜱蟲的生理特性
    1.4 幾種重要的蜱傳病毒
        1.4.1 克里-米亞剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)
        1.4.2 蜱傳腦炎病毒(Tick-borne Encephalitis virus)
        1.4.3 發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus)
        1.4.4 哈特蘭德病毒(Heartland Virus)
    1.5 NGS技術(shù)的應(yīng)用
    1.6 浙江舟山地區(qū)疾病流行特點(diǎn)
第二章 蜱蟲病毒宏基因組學(xué)研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 蜱蟲樣本
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材
        2.1.4 生物信息學(xué)分析軟件
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 蜱蟲的采集
        2.2.2 蜱蟲組織DNA提取
        2.2.3 PCR鑒定蜱蟲種群
        2.2.4 高通量測(cè)序樣本處理
        2.2.5 宏基因測(cè)序流程
        2.2.6 宏基組學(xué)注釋
        2.2.7 PCR檢測(cè)已注釋病毒
        2.2.8 PCR反應(yīng)產(chǎn)物鑒定
        2.2.9 PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化
        2.2.10 克隆培養(yǎng)及質(zhì)粒提取
        2.2.11 Dabieshan病毒基因組擴(kuò)增
        2.2.12 病毒系統(tǒng)進(jìn)化分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 樣本采集
        2.3.2 病毒宏基因組學(xué)分析
        2.3.3 Dabieshan病毒檢測(cè)
        2.3.4 DSP4 病毒檢測(cè)
        2.3.5 ZSP7 病毒檢測(cè)
        2.3.6 Bronnoya-like病毒檢測(cè)
        2.3.7 系統(tǒng)進(jìn)化分析
    2.4 討論
第三章 DABIESHAN病毒NP蛋白生物信息學(xué)分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 NP蛋白序列預(yù)測(cè)和進(jìn)化分析
        3.1.2 NP蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        3.1.3 NP蛋白一般特性分析
        3.1.4 NP蛋白跨膜域預(yù)測(cè)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 NP蛋白序列分析
        3.3.2 NP蛋白結(jié)構(gòu)分析
        3.3.3 NP蛋白一般特性
        3.3.4 NP蛋白跨膜域預(yù)測(cè)
    3.4 討論
第四章 重組NP蛋白的原核表達(dá)和多克隆抗體制備
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.3 主要試劑配制
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 構(gòu)建含酶切位點(diǎn)對(duì)的目的片段
        4.2.2 pET-32a空載質(zhì)粒制備
        4.2.3 空載體質(zhì)粒和目的片段連接
        4.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、克隆培養(yǎng)
        4.2.5 誘導(dǎo)原核表達(dá)以及表達(dá)形式鑒別
        4.2.6 目的蛋白純化
        4.2.7 多克隆抗體制備
        4.2.8 多克隆抗體純化
        4.2.9 多克隆抗體特異性鑒定
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證
        4.3.2 蛋白表達(dá)純化
        4.3.3 血清多克隆抗體效價(jià)測(cè)定
        4.3.4 多克隆抗體特異性鑒定
    4.4 討論
第五章 間接ELISA方法建立和人群血清學(xué)初步檢測(cè)
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 血清標(biāo)本
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑
        5.1.3 相關(guān)軟件
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 血清反應(yīng)特異性檢測(cè)
        5.2.2 包被NP抗原最佳濃度的確定
        5.2.3 酶標(biāo)二抗最佳濃度的確定
        5.2.4 底物作用最佳時(shí)間的確定
        5.2.5 板內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)
        5.2.6 人群血清學(xué)初步檢測(cè)
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1特異性實(shí)驗(yàn)
        5.3.2 棋盤滴定法確定最佳包被濃度
        5.3.3 確定最佳二抗作用濃度
        5.3.4 顯色時(shí)間的確定
        5.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
        5.3.6 人群血清學(xué)初步檢測(cè)
    5.4 討論
第六章 總結(jié)與展望
    6.1 主要結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
在校期間發(fā)表的論文及在學(xué)期間參加學(xué)術(shù)會(huì)議
    1.在校期間發(fā)表論文
    2.在學(xué)期間參加學(xué)術(shù)會(huì)議



本文編號(hào)：3742199