本文關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對外源轉(zhuǎn)基因成分檢測及其協(xié)同驗(yàn)證，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近些年來轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題受到了社會各界的廣泛關(guān)注,因此國家對轉(zhuǎn)基因食品安全的監(jiān)管力度也在逐步加強(qiáng)。目前對轉(zhuǎn)基因食品的檢測,除了常規(guī)的單靶標(biāo)核酸檢測外,還包括對多靶標(biāo)目的基因進(jìn)行篩選檢測和分析。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步,轉(zhuǎn)基因食品的檢測技術(shù)也正向著快速、精確、高通量的檢測方向發(fā)展。常規(guī)的轉(zhuǎn)基因食品檢測方法主要是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù),但這些轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)都需要精密復(fù)雜的溫度循環(huán)儀器而且檢測時(shí)間比較長,這樣就極大限制了它們在現(xiàn)場或者田間快速檢測的推廣和應(yīng)用。但近些年等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)得到了快速的發(fā)展,其中環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)憑著特異性和靈敏度高、簡單高效、所需儀器簡單等的優(yōu)勢在細(xì)菌、病毒、轉(zhuǎn)基因食品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本研究選擇了轉(zhuǎn)基因糧油原料中常見的3種外源轉(zhuǎn)基因成分,利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法對其外源轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測。根據(jù)這3種常見外源轉(zhuǎn)基因成分((CP4 epsps, Pat, NPTⅡ)的基因序列,設(shè)計(jì)特異性的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)引物,優(yōu)化反應(yīng)體系,并通過在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green Ⅰ (1000×)熒光染料,建立了可視化的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本研究建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法對這3.種外源轉(zhuǎn)基因成分(CP4 epsps, Pat, NPT Ⅱ)檢測的特異性高,靈敏度強(qiáng),檢測限基本上都能達(dá)到5-10拷貝,比傳統(tǒng)PCR的檢測限高,而且整個(gè)LAMP檢測過程僅需1小時(shí)左右,檢測結(jié)果可以通過瓊脂糖凝膠電泳和染料兩種方法來判斷。為了驗(yàn)證建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的實(shí)用性和有效性,我們邀請了國內(nèi)外10家研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行協(xié)同驗(yàn)證。對建立的LAMP檢測方法驗(yàn)證之后,將該方法運(yùn)用于樣品的實(shí)際檢測當(dāng)中。因此,環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的運(yùn)用不僅實(shí)現(xiàn)了快速、高效的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部檢測,而且也為現(xiàn)場或田間檢測提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。
【關(guān)鍵詞】：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 轉(zhuǎn)基因檢測 外源轉(zhuǎn)基因成分 協(xié)同驗(yàn)證
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R440;R155.5
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-8
• 第一章 緒論8-32
• 1 全球轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)化種植、應(yīng)用現(xiàn)狀8-13
• 1.1 全球轉(zhuǎn)基因種植的概況8-9
• 1.2 轉(zhuǎn)基因食品的概況9-10
• 1.3 轉(zhuǎn)基因食品安全性問題10-11
• 1.4 轉(zhuǎn)基因食品的安全性評價(jià)11-13
• 2 國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因食品檢測方法研究現(xiàn)狀13-18
• 2.1 以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測方法13-14
• 2.2 以核酸為基礎(chǔ)的檢測方法14-17
• 2.3 新型轉(zhuǎn)基因檢測方法17-18
• 2.4 轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)的展望18
• 3 轉(zhuǎn)基因食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測方法18-20
• 3.1 通用元件的篩選檢測19
• 3.2 外源特異性基因檢測19
• 3.3 構(gòu)建特異性檢測19
• 3.4 品系特異性檢測19-20
• 4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)20-28
• 4.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)概述20
• 4.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的特點(diǎn)20-21
• 4.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的引物設(shè)計(jì)21-22
• 4.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的擴(kuò)增原理22-24
• 4.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的操作過程24-25
• 4.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法25-26
• 4.7 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的應(yīng)用26-28
• 4.8 LAMP方法存在的問題和改進(jìn)28
• 5 本論文的研究內(nèi)容和意義28-32
• 5.1 研究背景及意義28-29
• 5.2 主要研究內(nèi)容29-30
• 5.3 本題目的創(chuàng)新之處和可預(yù)期的創(chuàng)造性成果30-32
• 第二章 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法對糧油原料外源轉(zhuǎn)基因成分檢測方法的建立32-53
• 1 材料與方法32-41
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑32-33
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法33-41
• 2 結(jié)果與分析41-49
• 2.1 LAMP檢測引物篩選結(jié)果41-42
• 2.2 LAMP體系優(yōu)化的結(jié)果42-45
• 2.3 LAMP方法特異性檢測結(jié)果45-46
• 2.4 LAMP方法靈敏度檢測結(jié)果46-49
• 3 討論49-52
• 3.1 植物基因組DNA的提取和質(zhì)量檢測49-50
• 3.2 LAMP檢測中引物的設(shè)計(jì)及篩選50-51
• 3.3 LAMP體系中不同因素的影響51
• 3.4 LAMP體系特異性、靈敏度評價(jià)51
• 3.5 LAMP方法的不足之處及解決措施51-52
• 4 本章小結(jié)52-53
• 第三章 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測方法的國際協(xié)同驗(yàn)證53-62
• 1 材料與方法53-57
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑53-54
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法54-57
• 2 結(jié)果與分析57-60
• 2.1 LAMP方法協(xié)同驗(yàn)證結(jié)果反饋57-58
• 2.2 LAMP方法的特異性驗(yàn)證結(jié)果58-59
• 2.3 LAMP方法的靈敏度驗(yàn)證結(jié)果59-60
• 3 討論60
• 3.1 國際協(xié)同驗(yàn)證特異性結(jié)果分析60
• 3.2 國際協(xié)同驗(yàn)證靈敏度結(jié)果分析60
• 4 本章小結(jié)60-62
• 第四章 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法在實(shí)際檢測中的應(yīng)用62-69
• 1 材料與方法62-64
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑62-63
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法63-64
• 2 結(jié)果與分析64-67
• 2.1 優(yōu)化的LAMP體系對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測的結(jié)果64
• 2.2 LAMP體系對上海出入境盲樣進(jìn)行檢測64-65
• 2.3 PCR方法對盲樣檢測結(jié)果的驗(yàn)證65-67
• 3 討論67-68
• 3.1 LAMP方法在實(shí)際樣品檢測中的優(yōu)勢67
• 3.2 LAMP方法在轉(zhuǎn)基因檢測中應(yīng)用前景67-68
• 4 本章小結(jié)68-69
• 參考文獻(xiàn)69-76
• 致謝76-78
• 攻讀碩士學(xué)位期間完成的論文78-79

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