本文關(guān)鍵詞：大鼠多器官原代細(xì)胞共培養(yǎng)模型及其應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：據(jù)統(tǒng)計(jì)，因?yàn)槎拘栽蛟馓蕴乃幬镎己钸x藥物的50%，其中約有30%的新藥是在中后期開發(fā)過程中因安全性問題被淘汰。因此，迫切需要發(fā)展新藥研制早期毒性篩選方法，以降低藥物在臨床前試驗(yàn)中因毒性的淘汰率。目前體外細(xì)胞培養(yǎng)方法通常采用一種細(xì)胞，只能評價(jià)受試物對該細(xì)胞的特定作用，而受試物在體內(nèi)具有器官選擇性；其次多數(shù)物質(zhì)在體內(nèi)需經(jīng)肝臟或其他代謝器官進(jìn)行代謝解毒或活化，而單一細(xì)胞只能采用體外活化系統(tǒng)S9模擬體內(nèi)的代謝情況；第三，在未知毒性靶器官時盲目采用某一器官細(xì)胞進(jìn)行毒性測試其預(yù)測價(jià)值就非常有限。 為此，本實(shí)驗(yàn)室發(fā)展了大鼠體外多器官細(xì)胞共培養(yǎng)模型，該模型能覆蓋多個主要靶器官，初步驗(yàn)證其具有較好的靶向性，在作為靶器官毒性篩選上有良好的發(fā)展前景。但該模型多器官細(xì)胞采用飛片法在培養(yǎng)板中共培養(yǎng)，存在通量低、操作復(fù)雜、所需受試物和培養(yǎng)基較多等問題，另外原模型中缺少神經(jīng)系統(tǒng)這一重要的毒物作用器官細(xì)胞，需要針對這些問題進(jìn)一步加以改進(jìn)。 過去十年，環(huán)境研究的焦點(diǎn)部分已從常規(guī)優(yōu)先污染物轉(zhuǎn)向新興（型）污染物。如在環(huán)境和食品中廣泛檢出抗生素等藥物，有的甚至發(fā)生人和動物中毒。由于這些藥物暴露途徑和方式不完全與臨床相同，需要研究其潛在的其它可能毒性。 由于納米材料特殊的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，其安全性引起了人們的廣泛關(guān)注。本課題擬在對大鼠多器官細(xì)胞共培養(yǎng)模型進(jìn)一步改進(jìn)和驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，通過對幾種常用的抗生素和抗腫瘤藥物進(jìn)行測試，進(jìn)一步揭示這幾種藥物的潛在毒性；通過比較研究具有不同尺度的納米二氧化鈦（Nano-TiO2），納米二氧化硅（Nano-SiO2）和納米氧化鋅（Nano-ZnO）三種納米物質(zhì)對代表多種器官的細(xì)胞的毒性及其特征，進(jìn)一步研究其靶器官特征，探討大鼠多器官原代細(xì)胞共培養(yǎng)方法是否可作為初篩納米物質(zhì)靶向性或研究其毒作用特征的模型，為其安全性評價(jià)提供依據(jù)。同時，也為進(jìn)一步改進(jìn)此模型提供依據(jù)。 方法 1、大鼠多器官原代細(xì)胞共培養(yǎng)模型采用代表五種主要靶器官的原代細(xì)胞進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng)，包括原代肝細(xì)胞，神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞，心肌細(xì)胞和腎皮質(zhì)細(xì)胞。采用自己改制的共培養(yǎng)細(xì)胞板，即將48孔培養(yǎng)板，以每6個孔為一單元，在每兩孔之間的壁下端打一孔，使6孔間培養(yǎng)基能相互連通。每種細(xì)胞先單獨(dú)分別接種于每個單元的6個孔中培養(yǎng)，另外設(shè)立一個陰性對照孔（即不接種任何細(xì)胞）。待各細(xì)胞貼壁后，加入較多的培養(yǎng)基使6個孔相互連通，在同一培養(yǎng)基、同一受試物濃度和相同的培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)五種器官的細(xì)胞，此即為48孔板大鼠多器官原代細(xì)胞共培養(yǎng)的模型。通過MTT比色法比較共培養(yǎng)和單培養(yǎng)條件下五種細(xì)胞在7天內(nèi)的生長增殖情況。通過已確定靶器官的毒性物質(zhì)百草枯、四氯化碳作用于此模型，觀察24h后兩種物質(zhì)對該模型中各細(xì)胞的毒作用特點(diǎn)，來驗(yàn)證此模型是否可以作為靶器官的初篩模型。2、將四種藥物注射用乳糖酸紅霉素，注射用硫酸鏈霉素，鹽酸阿霉素和白消安作用于48孔板大鼠多器官原代細(xì)胞共培養(yǎng)模型；不同尺度的Nano-TiO2（5-10nm，60nm，90nm），不同尺度的Nano-SiO2（15nm，50nm，100nm），不同尺度的Nano-ZnO（30nm，50nm，100nm）三種納米物質(zhì)作用于該模型；24h后觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并用MTT比色法測定細(xì)胞存活率，并計(jì)算各細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度。 結(jié)果 1、48孔板的共培養(yǎng)模型方法穩(wěn)定，細(xì)胞生長增殖狀況良好，與單獨(dú)培養(yǎng)時相比，無顯著性差異。根據(jù)IC50值，百草枯（甲基紫精）對肺泡巨噬細(xì)胞毒性最大，其次是腎皮質(zhì)細(xì)胞，對肝細(xì)胞毒性最小，這與目前整體動物顯示肺臟是最敏感的靶器官是一致的；CCl4對肝細(xì)胞毒性最大，其次是腎皮質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞，然后是心肌細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，這與目前整體動物顯示肝臟是的CCl4最敏感的靶器官是一致的。 2、四種藥物作用于共培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)：乳糖酸紅霉素對肺泡巨噬細(xì)胞的毒性最大，星形膠質(zhì)細(xì)胞次之，接著依次為心肌細(xì)胞、腎皮質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞；劑量-效應(yīng)曲線顯示乳糖酸紅霉素對各種細(xì)胞的毒性均具有明顯的劑量依賴關(guān)系。 根據(jù)IC50值，硫酸鏈霉素對肺泡巨噬細(xì)胞毒性作用最大，其次為腎皮質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞，然后是星形膠質(zhì)細(xì)胞和肝細(xì)胞；劑量-效應(yīng)曲線顯示，硫酸鏈霉素對各種細(xì)胞的毒性均具有明顯的劑量依賴關(guān)系且變化趨勢相近，細(xì)胞存活率隨藥物濃度的增大逐漸降低。 阿霉素對星形膠質(zhì)細(xì)胞IC50值最小，其余由小到大依次為肺泡巨噬細(xì)胞、腎皮質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞；劑量-效應(yīng)曲線顯示阿霉素對各種細(xì)胞的毒性均具有明顯的劑量依賴關(guān)系。 白消安對星形膠質(zhì)細(xì)胞的IC50值最小，其次是心肌細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，兩者相近，接著是肝細(xì)胞和腎皮質(zhì)細(xì)胞。劑量-效應(yīng)曲線顯示，除肝細(xì)胞外，白消安對各種細(xì)胞的毒性均具有明顯的劑量依賴關(guān)系，細(xì)胞存活率隨著藥物濃度的增大逐漸降低，以星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化趨勢最為明顯。 3、除5-10nm外，，同一尺度Nano-TiO2對大鼠多器官細(xì)胞共培養(yǎng)模型中不同細(xì)胞的毒性大小依次為：肺巨噬細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞心肌細(xì)胞肝細(xì)胞、腎皮質(zhì)細(xì)胞，這與目前整體動物毒性試驗(yàn)顯示肺是Nano-TiO2最敏感的靶器官是一致的。其中5-10nm TiO2對星形膠質(zhì)細(xì)胞的IC50值比肺泡巨噬細(xì)胞更低，提示隨著尺度的下降，神經(jīng)系統(tǒng)可能成為第二個靶器官。三種尺度Nano-TiO2對各器官細(xì)胞毒性的變化趨勢相近，均隨著尺度的下降細(xì)胞毒性增大，細(xì)胞毒性由大到小依次為：5-10nm60nm90nm。 三種尺度Nano-SiO2對各細(xì)胞的毒性均有明顯的劑量依賴關(guān)系，隨著Nano-SiO2濃度的增大，細(xì)胞毒性逐漸增大。同一尺度Nano-SiO2對大鼠多器官細(xì)胞共培養(yǎng)模型中不同細(xì)胞的毒性大小依次為：肺巨噬細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞心肌細(xì)胞肝細(xì)胞、腎皮質(zhì)細(xì)胞，這與目前整體動物毒性試驗(yàn)顯示肺是Nano-TiO2最敏感的靶器官是一致的。100nm和50nm的Nano-SiO2對各種細(xì)胞劑量-效應(yīng)曲線除斜率有差異外，變化趨勢相近；但15nm Nano-SiO2的曲線較其它兩種尺度的較陡，細(xì)胞存活率隨受試物濃度增加下降的更快。 三種尺度的Nano-ZnO對大鼠多器官細(xì)胞共培養(yǎng)模型中不同細(xì)胞的毒性大小依次為：心肌細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞肝細(xì)胞腎皮質(zhì)細(xì)胞、肺巨噬細(xì)胞，這與目前整體動物毒性試驗(yàn)顯示肺是Nano-ZnO最敏感的靶器官是一致的。不同尺度Nano-ZnO對各器官細(xì)胞毒性的變化趨勢相近，均隨著尺度的下降細(xì)胞毒性增大，細(xì)胞毒性大到小依次為：30nm50nm100nm。 結(jié)論 1、本試驗(yàn)將飛片法改為自己改制的48孔細(xì)胞共培養(yǎng)板、將原五種細(xì)胞中的真皮成纖維細(xì)胞改為星形膠質(zhì)細(xì)胞，修改建立的大鼠體外多器官原代細(xì)胞共培養(yǎng)模型是成功的；經(jīng)百草枯、四氯化碳的驗(yàn)證和四種新興污染物、三種納米材料的初步應(yīng)用，表明該方法在化學(xué)物靶向性篩選和毒作用特征研究上有良好的應(yīng)用前景。同時，應(yīng)用研究提示，肺泡巨噬細(xì)胞是否足以代表肺臟，有待進(jìn)一步改進(jìn)。 2、對幾種藥物也是新興污染物的紅霉素、鏈霉素、阿霉素和白消安的應(yīng)用研究表明，除了局部毒性不能檢測外，多數(shù)測試結(jié)果與已報(bào)道的器官毒性一致；除發(fā)現(xiàn)其在臨床上常見的毒性外，還發(fā)現(xiàn)了這幾種藥物一些可能的潛在毒性。 3、三種納米材料均有明顯的尺度效應(yīng)，隨著尺度的下降細(xì)胞毒性增大，敏感的器官細(xì)胞也增加，靶器官數(shù)目可能增加。Nano-TiO2的毒性靶器官可能是肺臟和神經(jīng)系統(tǒng)；Nano-SiO2的毒性靶器官可能是肺臟和神經(jīng)系統(tǒng)；Nano-ZnO的毒性靶器官可能是心臟。
【關(guān)鍵詞】：共培養(yǎng)模型 驗(yàn)證 新興污染物 納米物質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文縮略詞表12-13
• 前言13-14
• 第一部分 48 孔板大鼠多器官原代細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立及其驗(yàn)證14-27
• 一、材料和方法14-19
• 二、結(jié)果19-25
• 三、討論25-26
• 小結(jié)26-27
• 第二部分 大鼠多器官原代細(xì)胞共培養(yǎng)模型在新興污染物研究中的應(yīng)用27-39
• 一、材料和方法27-29
• 二、結(jié)果29-36
• 三、討論36-38
• 小結(jié)38-39
• 第三部分 大鼠多器官原代細(xì)胞共培養(yǎng)模型在納米物質(zhì)毒性研究中的應(yīng)用39-53
• 一、材料和方法39-41
• 二、結(jié)果41-50
• 三、討論50-53
• 全文總結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 綜述57-64
• 參考文獻(xiàn)62-64
• 在讀期間發(fā)表論文情況64-65
• 致謝65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：315148