本文關(guān)鍵詞：BMSCs抑制矽肺大鼠肺泡巨噬細胞自噬活化的體外研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的通過體內(nèi)染塵制備大鼠矽肺模型和體外細胞培養(yǎng)實驗，探討：1.在大鼠矽肺的發(fā)生過程中AM內(nèi)是否存在自噬的激活；2. BMSCs移植對AM自噬的調(diào)控影響；3. BMSCs對AM自噬的調(diào)控與PI3K-AKT-mTOR-P70S6K信號通路的關(guān)系。 方法1.動物分組及模型制備：90只SPF級雄性SD大鼠（體質(zhì)量180~220g）隨機分為三組：模型對照組（control group）、矽肺模型組（model group）、BMSCs治療組（BMSCs treatment group）；5只SPF級雄性SD大鼠（3~5周齡，體質(zhì)量100~120g）用于BMSCs分離及培養(yǎng)。采用非暴露式一次性氣管灌注法制備大鼠矽肺模型，一次性灌注滅菌氯化鈉溶液與SiO2粉塵混懸液（50mg/ml）1.0ml；模型對照組灌注滅菌氯化鈉溶液1.0ml；BMSCs治療組于造模24h后經(jīng)尾靜脈注入BMSCs混懸液1.0ml，約3×106個細胞。2.檢測指標及方法：①BMSCs的鑒定：流式細胞儀檢測BMSCs表面標記物CD29，CD45，CD54，CD106的表達；②一般形態(tài)學(xué)觀察：蘇木素-伊紅（HE）染色觀察AM形態(tài)；③免疫細胞化學(xué)染色法檢測LC-3，Beclin-1，mTOR，P70S6K的表達及分布；④免疫印跡法檢測LC-3，Beclin-1，mTOR，P70S6K的蛋白表達量；⑤透射電鏡觀察自噬體的形成。3.定量測定及統(tǒng)計學(xué)分析：免疫細胞化學(xué)陽性細胞陽性度強弱用Image-ProPlus6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)半定量分析測定，以積分光密度值（IOD值）來表示。蛋白定量用Image J醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對PVDF膜上蛋白特異表達條帶進行半定量分析，得出平均光密度值（OD值），最后以目標OD值比內(nèi)參（β-actin）OD值的比值作為分析對象進行比較。實驗中所得數(shù)據(jù)用Excel建庫，均用均值±標準差（x±s）表示，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行完全隨機設(shè)計的單因素方差分析，兩組間比較用qq檢驗，以P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果1. BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：BMSCs原代細胞胞體小，基本為均勻梭形或圓形，核居中，偶有寬大扁平的多邊形細胞，細胞折光性強，以分散的克隆聚集方式增殖。10d后原代細胞95％融合，此時進行傳代，細胞傳至第三代，形態(tài)更為均一，呈梭形成纖維細胞樣。2. BMSCs表面標記物表達的鑒定結(jié)果：結(jié)果顯示細胞CD29、CD106抗體陽性表達率分別為75.04％、75.49％，為陽性表達，CD45、CD54抗體陽性表達率分別為4.07％、4.85％，為陰性表達。3. AM的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示模型對照組AM圓形或橢圓形，結(jié)構(gòu)清晰，輪廓清楚，形態(tài)均一，未見矽塵吞噬顆粒。與模型對照組相比，矽肺模型組AM體積增大，圓形、橢圓形或不規(guī)則形，形態(tài)不均一，細胞輪廓不清，部分細胞可看到毛刺樣突起，細胞核位于細胞中央或一側(cè)，胞質(zhì)更加疏松豐富，部分細胞胞質(zhì)內(nèi)可見吞噬的矽塵顆粒。BMSCs治療組與矽肺模型組相比，AM受損程度有所減輕，細胞形態(tài)不均一。4.免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果：模型對照組LC-3，Beclin-1僅有微弱表達，呈現(xiàn)淡棕黃色。與模型對照組相比，矽肺模型組在各時間點的陽性表達均增強（P0.05），并且其表達變化呈現(xiàn)出時間依賴性變化趨勢，隨著時間延長，表達強度逐漸增加，其表達至14d時達高峰（P0.05），28d時有所降低，但仍高于模型對照組的表達（P0.05）。與矽肺模型組相比，BMSCs治療組在各時間點的表達均減弱（P0.05），但表達趨勢未變。模型對照組mTOR，P70S6K蛋白有一定量表達，呈現(xiàn)棕褐色。與模型對照組相比，矽肺模型組在各時間點的陽性表達均減弱（P0.05），并且其表達變化呈現(xiàn)出時間依賴性變化趨勢，隨著時間延長，表達強度逐漸降低，其14d時表達至低峰（P0.05），28d時有所回升，但仍低于模型對照組的表達（P0.05）。與矽肺模型組相比，BMSCs治療組在各時間點的表達均增強（P0.05），但表達趨勢未變。5. Western blot檢測結(jié)果：在模型對照組LC-3，Beclin-1蛋白僅有微量基礎(chǔ)表達，，且各時間點間表達無明顯變化。矽肺模型組和BMSCs治療組LC-3，Beclin-1動態(tài)表達與免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果相吻合。在模型對照組mTOR，P70S6K蛋白有一定量的基礎(chǔ)表達，且各時間點間表達無明顯變化。矽肺模型組和BMSCs治療組mTOR，P70S6K動態(tài)表達與免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果相吻合。6.透射電鏡結(jié)果：模型對照組AM胞質(zhì)內(nèi)細胞器豐富，完整，細胞基質(zhì)均勻一致，溶酶體豐富，線粒體結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰，核膜完整、連續(xù)，核染色質(zhì)分布正常。矽肺模型組AM胞質(zhì)內(nèi)可見SiO2吞噬顆粒，在細胞核周圍，線粒體附近，有雙層膜包被的圓形或橢圓形自噬體形成，可見雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬前體，呈新月形或杯狀。 結(jié)論1.在大鼠矽肺的發(fā)生發(fā)展過程中AM內(nèi)存在自噬的激活，AM自噬參與了矽肺的病理進程；2. BMSCs移植可以抑制AM內(nèi)自噬的過度激活；3. BMSCs通過調(diào)控PI3K-AKT-mTOR-P70S6K信號通路，最終抑制AM自噬。
【關(guān)鍵詞】：矽肺 骨髓間充質(zhì)干細胞 肺泡巨噬細胞 自噬 LC-3 Beclin-1 mTOR P70S6K
【學(xué)位授予單位】：河北聯(lián)合大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R135.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 引言12-14
• 第1章 實驗研究14-52
• 1.1 材料與方法14-26
• 1.1.1 實驗材料14-19
• 1.1.2 實驗方法19-25
• 1.1.3 結(jié)果判定及統(tǒng)計學(xué)處理25-26
• 1.2 結(jié)果26-43
• 1.2.1 BMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察26-27
• 1.2.2 BMSCs 表面標記物表達的鑒定結(jié)果27-28
• 1.2.3 AM 的形態(tài)學(xué)觀察28-29
• 1.2.4 免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果29-35
• 1.2.5 Western blot 檢測結(jié)果35-42
• 1.2.6 透射電鏡檢測結(jié)果42-43
• 1.3 討論43-47
• 1.3.1 AM 在矽肺纖維化中的作用43-45
• 1.3.2 AM 自噬參與矽肺的病理進程45-46
• 1.3.3 BMSCs 通過激活 mTOR 通路進而抑制 AM 自噬46-47
• 1.4 結(jié)論47
• 參考文獻47-52
• 第2章 綜述52-66
• 2.1 自噬的發(fā)生機制52-54
• 2.2 自噬與炎癥及免疫應(yīng)答的相互作用54-56
• 2.2.1 自噬與炎性信號54-55
• 2.2.2 自噬與適應(yīng)性免疫應(yīng)答55-56
• 2.3 自噬在炎性疾病中的作用56-58
• 2.3.1 自噬在克羅恩病疾病中的作用56-57
• 2.3.2 自噬在呼吸道感染中的作用57-58
• 2.3.3 自噬在敗血癥中的作用58
• 2.4 自噬在肺疾病中的作用58-60
• 2.4.1 自噬相關(guān)蛋白 LC3B 在肺性高血壓中的作用58-59
• 2.4.2 自噬在囊性纖維化中的作用59-60
• 2.5 結(jié)語60
• 參考文獻60-66
• 致謝66-67
• 導(dǎo)師簡介67-68
• 作者簡介68-69
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 高俊玲,田艷霞,崔建忠,張宇新,孫樹勛;矽塵致肺泡巨噬細胞氧化損傷的超微結(jié)構(gòu)和細胞化學(xué)研究[J];解剖學(xué)雜志;2000年02期

2 徐萍;王s

本文編號：314334