本文關(guān)鍵詞：鹵代醌類化合物介導(dǎo)肝細胞炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的信號通路分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鹵代醌類化合物是環(huán)境中廣泛存在的一類持久有機污染物,它們主要由多鹵代芳香族化合物通過化學反應(yīng)、酶促反應(yīng)以及生物體內(nèi)代謝等多種途徑脫鹵形成,在以上過程中形成了大量中間產(chǎn)物,這些中間產(chǎn)物多具有細胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性等多種毒性效應(yīng),嚴重威脅著人類健康。本課題分為兩個部分,從體內(nèi)和體外水平揭示鹵代醌類化合物的毒性機制,為完善鹵代醌類化合物毒性機制提供新的內(nèi)容,為鹵代醌類化合物引起疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。第一部分：姜黃素拮抗四氯苯醌誘導(dǎo)小鼠肝損傷的機制研究四氯苯醌(TCBQ)由廣泛應(yīng)用的木材防腐劑五氯酚(PCP)代謝產(chǎn)生,代謝過程發(fā)生氧化還原反應(yīng),并由此產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),從而造成機體氧化損傷。肝臟是人體主要的代謝與解毒器官,TCBQ在體內(nèi)代謝可能會造成肝臟損傷。姜黃素(Curcumin)是從姜黃根莖中提取的一種天然多酚產(chǎn)物,具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗凝、降血脂、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用。它抗氧化與清除自由基的作用能夠保護機體免受氧化應(yīng)激的損傷。同時,在本實驗中我們研究了姜黃素拮抗四氯苯醌誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的作用機制。本實驗利用四氯苯醌(TCBQ)建立小鼠急性肝損傷模型,我們把32只昆明小鼠隨機分為四組,每組8只：對照組、姜黃素組、TCBQ組和TCBQ+姜黃素組。對照組小鼠給予等量的溶劑,姜黃素組小鼠連續(xù)5天給予姜黃素,TCBQ組小鼠給予單劑量的TCBQ, TCBQ+姜黃素組小鼠連續(xù)5天腹腔注射給予姜黃素,在最后一次給予姜黃素3小時后腹腔注射給予TCBQ,24小時后取小鼠血清及肝臟檢測肝臟損傷相關(guān)指標。我們在血清中檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平,在肝臟中檢測TBARS、SOD、CAT水平。這些結(jié)果顯示四氯苯醌對小鼠肝臟造成了嚴重的損傷。HE染色觀察肝臟病理學變化,結(jié)果顯示TCBQ組中有大量的炎癥細胞浸潤,說明在這肝臟中存在炎癥反應(yīng)。iNOS、COX-2免疫組化和p65、TNF-α、IL-6、IL-β、IκB、P-IκB Western blot結(jié)果進一步證明了四氯苯醌誘導(dǎo)的肝損傷主要為炎癥反應(yīng)。我們進一步考察了凋亡相關(guān)蛋白Bax、 Bc1-2、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的表達,發(fā)現(xiàn)TCBQ組中這些蛋白的表達與其它組相比沒有明顯變化。Cleaved Caspase 3免疫組化結(jié)果也無明顯變化。這表明四氯苯醌不引起肝細胞凋亡有研究表明,姜黃素的保護作用歸因于它清除自由基的能力,因此,我們選取重要的抗氧化信號通路Nrf2/Keap1/ARE作為研究對象。實驗結(jié)果顯示姜黃素激活了Nrf2/Keap1/ARE信號通路,對四氯苯醌誘導(dǎo)的急性肝損傷發(fā)揮了較好的拮抗作用。以上研究表明四氯苯醌誘導(dǎo)的急性肝損傷主要為炎癥反應(yīng),但不引起肝細胞凋亡。姜黃素通過激活Nrf2/Keap1/ARE信號通路,調(diào)節(jié)Ⅱ相代謝酶HO-1、NQO1在肝組織的表達,從而達到保護肝臟的作用。第二部分：多氯聯(lián)苯醌通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)HepG2田胞凋亡的機制分析多氯聯(lián)苯醌(PCBQ)是氯代芳香族化合物多氯聯(lián)苯(PCBs)的主要代謝產(chǎn)物。近年有研究報道,PCBs代謝產(chǎn)物可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),進而造成氧化損傷。而氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和凋亡有密切聯(lián)系,這就提示我們多氯聯(lián)苯醌可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及凋亡。本實驗選用人肝癌HepG2細胞作為研究對象,以考察多氯聯(lián)苯醌是否能夠在HepG2細胞中誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及凋亡的發(fā)生。首先,在熒光顯微鏡和透射電鏡下觀察HepG2細胞及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在未加PCB29-pQ與加入10 μM PCB29-pQ處理48 h后的形態(tài)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給藥組細胞中出現(xiàn)了凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的典型特征。然后從濃度梯度和時間梯度上分別考察PCB29-pQ誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達情況,并用RT-PCR分析基因Bip、GRP94、XBP-1的mRNA表達水平。與對照組相比,PCB29-pQ處理的細胞相應(yīng)蛋白和基因的表達量均有明顯提高。用流式細胞儀檢測PCB29-pQ引起細胞內(nèi)鈣水平的變化。實驗結(jié)果表明PCB29-pQ能夠提高細胞內(nèi)鈣水平。這些結(jié)果說明了PCB29-pQ能夠誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在形態(tài)學考察中發(fā)現(xiàn)PCB29-pQ處理的細胞有明顯的凋亡現(xiàn)象,因此,我們根據(jù)文獻報道選取了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中三條參與凋亡調(diào)控的信號通路：PERK/eIF2α/ATF4/CHOP、Caspase 12/Caspase 9/Caspase 3和IRE1α/JNK/c-Jun進行研究。一系列實驗結(jié)果證明,PCB29-pQ通過激活PERK/eIF2a/ATF4/CHOP、Caspase 12/Caspase 9/Caspase 3信號通路誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡。接著用加入鈣離子螯合劑BAPTA-AM和ROS清除劑NAC的方法以考察PCB29-pQ引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的原因。結(jié)果表明,PCB29-pQ引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激受細胞內(nèi)鈣離子和ROS水平的調(diào)節(jié)。根據(jù)以上研究可知,PCB29-pQ能夠誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并受細胞內(nèi)鈣離子濃度和ROS水平的調(diào)節(jié)。PCB29-pQ引起的凋亡受PERK/eIF2a/ATF4/CHOP和Caspase 12/Caspase 9/Caspase 3信號通路的調(diào)控,而IRE1α/JNK/c-Jun通路在本實驗中沒有被激活,未參與PCB29-pQ引起的細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：四氯苯醌 多氯聯(lián)苯醌 氧化應(yīng)激 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 凋亡
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 縮寫符號對照表14-15
• 第一章 緒論15-21
• 1.1 持久有機污染物的定義及特點15
• 1.2 持久有機污染物的分類及來源15-16
• 1.3 持久有機污染物的危害16-18
• 1.3.1 六氯苯的毒性16
• 1.3.2 多氯聯(lián)苯的毒性16-18
• 1.4 國外POPs研究概況18
• 1.5 我國現(xiàn)狀18-19
• 1.6 立題意義19-21
• 第二章 姜黃素拮抗四氯苯醌誘導(dǎo)小鼠肝損傷機制研究21-35
• 2.1 前言21-22
• 2.1.1 活性氧類(ROS)21-22
• 2.1.2 姜黃素及其抗氧化作用機制22
• 2.1.3 本課題研究目的22
• 2.2 實驗材料22-24
• 2.2.1 試劑22-23
• 2.2.2 動物23
• 2.2.3 主要儀器設(shè)備23
• 2.2.4 常用試劑制備方法23-24
• 2.3 實驗方法24-27
• 2.3.1 實驗?zāi)Ｐ偷慕?/span>24
• 2.3.2 檢測血清中ALT、AST活性24
• 2.3.3 組織病理學檢查24-25
• 2.3.4 檢測脂質(zhì)過氧化物和抗氧化酶25
• 2.3.5 iNOS活性測定25
• 2.3.6 免疫組化染色25-26
• 2.3.7 核提取物的制備26
• 2.3.8 全蛋白提取物的制備26
• 2.3.9 Western-blot檢測26-27
• 2.3.10 數(shù)據(jù)分析27
• 2.4 實驗結(jié)果與討論27-35
• 2.4.1 TCBQ和姜黃素對血清中AST、ALT水平的影響27
• 2.4.2 TCBQ和姜黃素對組織病理損傷的影響27-28
• 2.4.3 TCBQ和姜黃素對TBARS形成的影響28-29
• 2.4.4 TCBQ和姜黃素對肝抗氧化物酶活性的影響29
• 2.4.5 TCBQ和姜黃素對COX-2和iNOS表達的影響29-30
• 2.4.6 TCBQ和姜黃素對NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β表達的影響30-31
• 2.4.7 TCBQ和姜黃素對Caspase 3、Caspase 8、Caspase 12、Bcl-2、Bax表達的影響31-32
• 2.4.8 TCBQ和姜黃素對Nrf2信號通路的激活和HO-1/NQO1表達的影響32-33
• 2.4.9 討論33-35
• 第三章 多氯聯(lián)苯醌通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的機制分析35-53
• 3.1 前言35-37
• 3.1.1 未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)35-36
• 3.1.2 Caspase 1236
• 3.1.3 鈣蛋白酶36
• 3.1.4 鈣離子(Ca~(2+))36-37
• 3.1.5 本課題提出背景及研究目的37
• 3.2 實驗材料37-38
• 3.2.1 試劑37-38
• 3.2.2 細胞38
• 3.2.3 主要儀器設(shè)備38
• 3.3 實驗方法38-41
• 3.3.1 細胞培養(yǎng)38
• 3.3.2 實驗分組38-39
• 3.3.3 透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)39
• 3.3.4 流式細胞儀檢測凋亡39
• 3.3.5 細胞內(nèi)ROS檢測39
• 3.3.6 細胞內(nèi)鈣離子濃度檢測39-40
• 3.3.7 鈣蛋白酶活性分析40
• 3.3.8 細胞全蛋白提取物制備40
• 3.3.9 Western-blot檢測40
• 3.3.10 實時熒光定量PCR分析40-41
• 3.3.11 數(shù)據(jù)分析41
• 3.4 實驗結(jié)果與討論41-53
• 3.4.1 PCB29-pQ誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡41-42
• 3.4.2 PCB29-pQ誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)42-44
• 3.4.3 PCB29-pQ激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡44-45
• 3.4.4 PCB29-pQ激活Caspase12/Caspase 9/Caspase 3通路誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡45-46
• 3.4.5 PCB29-pQ對IRE1α/XBP-1通路的影響46-47
• 3.4.6 PCB29-pQ對細胞內(nèi)鈣離子水平和鈣蛋白酶活性的影響47-48
• 3.4.7 考察ROS水平對PCB29-pQ誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響48-50
• 3.4.8 討論50-53
• 參考文獻53-61
• 致謝61-63
• 科研成果63

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  本文關(guān)鍵詞：鹵代醌類化合物介導(dǎo)肝細胞炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的信號通路分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：291916