目的:稀土元素(rare earth element,REEs)包括元素周期表中的鑭系元素以及同族的鈧和釔共17種元素,可分為以鑭(Lanthanum,La)、鈰為代表的輕稀土元素和以釔、镥為代表的重稀土元素。REEs可通過呼吸道,消化道等多種途徑進(jìn)入人體并在組織器官中蓄積,引起肝臟、腎臟、免疫、神經(jīng)和內(nèi)分泌等多個(gè)系統(tǒng)的損害。其中神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)REEs的的毒性十分敏感,其損害作用受到了廣泛關(guān)注。已有流行病學(xué)調(diào)查顯示,稀土礦區(qū)兒童的智力發(fā)育水平顯著低于非稀土區(qū)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)REEs可使受試動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙、神經(jīng)行為能力和學(xué)習(xí)記憶能力下降。由于La的化學(xué)性質(zhì)活潑,在自然界中較為豐富,常被作為研究REEs神經(jīng)毒性的代表物質(zhì)。有報(bào)道顯示稀土礦區(qū)兒童的血La含量是對(duì)照組兒童的2.26倍。Feng等研究發(fā)現(xiàn)大鼠連續(xù)6 w經(jīng)灌胃攝入氯化鑭(lanthanum chloride,LaCl3)(2 mg/kg BW/day)后,海馬中的 La 含量為0.014 ± 0.007 μg/g。每日在小雞腦內(nèi)注射2 mg/kg LaCl3,連續(xù)lw可明顯損害其長時(shí)程記憶過程。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)La會(huì)導(dǎo)致大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元的線粒體功能紊亂,星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷。以上研究表明鑭具有明顯的神經(jīng)毒性,但其所致神經(jīng)毒作用的確切機(jī)制尚不完全明確。谷氨酸(glutamate,Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì),對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸可塑性維持、神經(jīng)元回路形成及學(xué)習(xí)記憶過程起到關(guān)鍵作用。生理狀態(tài)下Glu的合成、分解、攝取和重吸收是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程。Glu主要儲(chǔ)存在突觸前神經(jīng)元的囊泡內(nèi),當(dāng)突觸前神經(jīng)元受到刺激時(shí),釋放Glu至突觸間隙中,與突觸后膜上的谷氨酸受體結(jié)合并將其激活,由此發(fā)揮Glu的神經(jīng)遞質(zhì)功能。幾乎與此同時(shí),突觸間隙中多余的Glu會(huì)通過“Glu-谷氨酰胺(glutamine,Gln)循環(huán)”的方式被重新攝取,經(jīng)歷代謝、釋放的過程,再次儲(chǔ)存于突觸囊泡內(nèi),等待下一次興奮傳遞的到來。星形膠質(zhì)細(xì)胞在這一循環(huán)中發(fā)揮了重要作用。當(dāng)該類細(xì)胞受損時(shí),Glu無法被快速攝取,就會(huì)造成其在突觸間隙中的大量累積,進(jìn)而過度激活谷氨酸受體,引起興奮性毒性。N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體是一種離子型谷氨酸受體,與學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)系密切。Morris等人的研究發(fā)現(xiàn),緩慢向心室內(nèi)注入NMDA受體阻滯劑AP5,可明顯抑制大鼠海馬突觸傳遞長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation,LTP)和空間學(xué)習(xí)記憶能力。LTP是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)之一,目前被認(rèn)為是研究學(xué)習(xí)與記憶的細(xì)胞模型。在正常生理情況下,突觸間隙中的Glu會(huì)激活NMDA受體,誘導(dǎo)產(chǎn)生LTP,由此實(shí)現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶過程。然而在病理情況下,Glu過度激活NMDA受體會(huì)造成離子通道持續(xù)開發(fā),引發(fā)Ca2+大量內(nèi)流,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡基于上述證據(jù),本課題擬通過體內(nèi)和體外試驗(yàn),從Glu這一興奮性神經(jīng)遞質(zhì)出發(fā),通過研究Glu-Gln循環(huán)和Glu的重要受體NMDA受體的表達(dá)情況來探索La致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的分子生物學(xué)機(jī)制,為尋找有效干預(yù)La所致神經(jīng)毒作用的分子生物學(xué)靶點(diǎn)提供可靠的試驗(yàn)資料與科學(xué)依據(jù)。研究方法:整體動(dòng)物試驗(yàn),由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康成年Wistar大鼠總計(jì)80只(雌性:雄性=1:1),體重260±10g,于動(dòng)物室飼養(yǎng)1w左右以適應(yīng)周圍環(huán)境。根據(jù)隨機(jī)化原則將雌性和雄性大鼠按照1:1同籠進(jìn)行交配,次日清晨發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物鏡檢有精子者記為妊娠第Od并開始染毒,隨機(jī)將孕鼠分為對(duì)照組(飲用蒸餾水);0.125%LaCl3劑量組(飲用含0.125%LaCl3的蒸餾水溶液);0.25%LaCl3劑量組(飲用含0.25%LaCL3的蒸餾水溶液)和0.5%LaCl3劑量組(飲用含0.5%LaCl3的蒸餾水溶液)。孕鼠單籠飼養(yǎng)并自由攝水。子代大鼠在斷乳前經(jīng)吸吮母乳染La,斷乳后自由飲水染La,至斷乳后1個(gè)月。染毒結(jié)束后進(jìn)行各種指標(biāo)測定。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定大鼠海馬及皮質(zhì)組織中La含量。采用Morris水迷宮和穿梭箱試驗(yàn)測定大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,采用電生理試驗(yàn)觀察大鼠海馬CA1區(qū)LTP誘導(dǎo)及維持情況,采用透射電子顯微鏡技術(shù)觀察大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,采用微透析聯(lián)合高效液相色譜法檢測大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞外液中Glu及Gln含量,采用Real time PCR法,Western blot法檢測大鼠海馬及皮質(zhì)組織中GLAST、GLT-1、GS、PAG、GluNl、GluN2A、GLuN2B的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。體外試驗(yàn)使用出生24 h內(nèi)的wistar大鼠進(jìn)行大腦皮層原代神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)。采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)分別鑒定神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。采用微透析聯(lián)合高效液相色譜法檢測培養(yǎng)液中Glu及Gln含量,采用 Real time PCR 法,Western blot 法檢測細(xì)胞中 GLAST、GLT-1、GS、PAG、GluN1、GluN2A、GluN2B的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平,采用TUNEL法測定神經(jīng)元凋亡率。使用MK801及5,7-二氯犬尿烯酸(5,7-dichlorokynurenic,DDKA)干預(yù)后,再次測定神經(jīng)元相關(guān)指標(biāo),驗(yàn)證La所致“Glu-Gln循環(huán)”障礙引起的NMDA受體過度激活對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的不利影響。結(jié)果:1.LaCl3暴露可造成大鼠海馬及皮質(zhì)組織中的La蓄積。2.LaCl3對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響:在Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)中,隨著染La劑量增加,大鼠找到水下平臺(tái)的潛伏期和游泳距離逐漸增加;與對(duì)照組相比,大鼠尋找平臺(tái)的路徑表現(xiàn)出雜亂,無目的性,用時(shí)增加,游泳距離增長。在空間探索試驗(yàn)中,染La組大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間和穿越目標(biāo)象限的次數(shù)明顯低于對(duì)照組,搜索平臺(tái)策略目的性降低,甚至很少進(jìn)入目標(biāo)象限。在穿梭箱試驗(yàn)中,染La組大鼠受電擊次數(shù)、電擊時(shí)間及主動(dòng)逃避潛伏期時(shí)間均顯著高于對(duì)照組,學(xué)習(xí)記憶能力下降。3.在電生理試驗(yàn)中,高頻刺激之前,染La組大鼠PS平均幅值略有降低趨勢(shì),但沒有明顯差異;而在高頻刺激后,La暴露組大鼠海馬CA1 區(qū)PS平均幅值增強(qiáng)率明顯低于對(duì)照組,LTP受到抑制。4.LaCl3對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響:對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較豐富,核膜邊緣光滑連續(xù)完整;La處理組大鼠海馬神經(jīng)元中出現(xiàn)細(xì)胞核膜界限模糊,線粒體腫脹,細(xì)胞器減少。5.La暴露導(dǎo)致體內(nèi)試驗(yàn)大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞間隙中,體外星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中Glu含量升高。6.體內(nèi)和體外試驗(yàn)結(jié)果均顯示La暴露導(dǎo)致谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST和GLT-1,谷氨酸代謝相關(guān)酶GS和PAG的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平下調(diào);NMDA受體亞單位GluN1、GluN2A和GluN2B的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平上調(diào)。7.LaCl3對(duì)神經(jīng)元凋亡率的影響:體外實(shí)驗(yàn)中,隨著LaCl3處理濃度的增加,神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率逐漸增加。8.MK801和DCDA對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用:神經(jīng)元用MK801和DCDA進(jìn)行預(yù)處理后,可下調(diào)NMDA受體亞單位GluN1、GluN2A和GluN2B的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平,并使神經(jīng)元凋亡率降低。結(jié)論:1、LaCl3暴露可造成大鼠海馬及皮質(zhì)組織中的La蓄積。2、La可使大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降,LTP受到抑制。3、體內(nèi)、體外試驗(yàn)中,La可使細(xì)胞外液中Glu含量升高,“Glu-Gln循環(huán)”障礙,NMDA受體過度表達(dá)。4、La可明顯影響神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu),并使神經(jīng)元的凋亡率明顯升高。5、使用MK801和DCDA進(jìn)行預(yù)處理,可下調(diào)NMDA受體的表達(dá),拮抗La對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

11.1.1星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定圖3.1為星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定結(jié)果。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性蛋白，根據(jù)GFAP的免疫組化染色可判斷培養(yǎng)的細(xì)胞是否為星形膠質(zhì)細(xì)胞。由圖3.1可見，大部分細(xì)胞的胞漿被染成棕黃色，這是GFAP與其抗體結(jié)合著色所致。經(jīng)計(jì)算GFAP細(xì)胞陽性率大于95%，故認(rèn)為該細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖3.1星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)鑒定（20X）11.1.2神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)細(xì)胞至第6～7 d，采用免疫細(xì)胞熒光方法進(jìn)行鑒定。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）高特異性的定位于神經(jīng)元，故采用NSE一抗對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。鏡下見大部分細(xì)胞被標(biāo)記為綠色

圖3.2神經(jīng)元的鑒定（20X）Cl3 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響MTT法檢測LaCl3 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響。使用不同濃度的養(yǎng)至F3代的星形膠質(zhì)細(xì)胞，24 h后采用MTT法測定細(xì)胞存活隨著LaCl3 處理濃度的增加，與對(duì)照組相比，星形膠質(zhì)細(xì)胞的存有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。根據(jù)細(xì)胞毒性試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)劑量的半數(shù)致死濃度）確定，故本研究選擇處理濃度為0，0.125，0.25，0行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

GS酶活力的影響如圖3.8所示，與對(duì)照組相比，染La組星形膠質(zhì)細(xì)胞中GS酶活力顯著下降，并隨染毒劑量的增加而降低(P<0.05)。圖3.8 LaCl3 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GS酶活力的影響注：與對(duì)照組比較，*P <0.05；與0.125mM LaCl3 組比較，#P <0.05；與0.25mM LaCl3 組比較，&P <0.05。11.6 LaCl3 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GLAST，GLT-1及GS轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平的影響
【參考文獻(xiàn)】

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