金剛烷胺(AMD)是一種人用抗病毒藥物,最早用于預(yù)防和治療流感,也曾被用作治療禽流感、豬流感和豬腸胃炎而廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。然而,過量的AMD會通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積,對人產(chǎn)生神經(jīng)毒害并導(dǎo)致嚴重的病毒耐藥性,故我國現(xiàn)已明令禁止其作為獸藥使用。本文建立了一種新型酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)和一種膠體金免疫層析方法(CG-ICA),實現(xiàn)了對AMD的定性檢測。建立的方法準(zhǔn)確度高、特異性好、無需儀器,適合基層推廣使用。在第二章中,首先合成了AMD半抗原,再通過EDC/NHS介導(dǎo)合成AMD人工抗原。通過質(zhì)譜和紫外-可見光譜表征,分別確認了半抗原和人工抗原的成功合成。用人工抗原對小鼠進行免疫,并通過間接競爭ELISA對小鼠抗血清進行效價和抑制情況評價。在第三章中,建立了一種基于DNA堿基互補配對和非共價交聯(lián)膠體(Au NPs)的新型ELISA檢測AMD。將AMD單克隆抗體(m Ab)和Primer 1偶聯(lián)在膠體金表面得到抗體-膠體金-Primer 1新型探針,并用于后續(xù)檢測。向包被有AMD人工抗原的酶標(biāo)孔中加入AMD標(biāo)準(zhǔn)品和抗體-膠體金-Primer 1金標(biāo)探針,然后加入與Primer 1互補的Primer 2進行雜交配對。隨后吸取上清中游離的Primer 2,先后向其中加入膠體金和Na Cl溶液,并觀察膠體金溶液顏色變化,從而對體系中的AMD進行定性分析。單鏈DNA能提高膠體金對鹽離子的耐受能力,膠體金表面的單鏈DNA的含量越高,膠體金對鹽離子的耐受能力越強。AMD濃度的降低會引起游離Primer 2濃度的降低,使得膠體金對鹽離子的耐受能力減弱,使膠體金聚集變藍,反之膠體金溶液保持紅色。當(dāng)AMD人工抗原包被濃度為1.0μg/m L、Primer 1濃度為0.3μM、AMD抗體標(biāo)記量為8μg/m L、Primer 2濃度為0.2μM、抗體-膠體金-Primer 1金標(biāo)復(fù)合物重懸液體積為1 m L、顯色用膠體金粒徑為13 nm、濃度為5.8 n M時,方法靈敏度為0.033μM。本方法與AMD結(jié)構(gòu)類似物和其他常見獸藥均不產(chǎn)生交叉反應(yīng),特異性良好。在第四章中,研制了一種膠體金免疫層析檢測卡對雞肉中的AMD進行定性檢測。制備了金標(biāo)抗體探針,并在檢測線和質(zhì)控線上分別噴涂AMD人工抗原和羊抗鼠二抗。經(jīng)優(yōu)化,最優(yōu)條件確定為:膠體金標(biāo)記p H為6.5、抗體標(biāo)記量為4μg/m L、T線人工抗原濃度為1.5 mg/m L、C線二抗?jié)舛葹?.6 mg/m L、結(jié)合墊上金標(biāo)抗體的噴量為6μL/cm。在最優(yōu)條件下本方法的靈敏度為1.5ng/m L,在實際樣本中的檢測靈敏度為5μg/kg,與結(jié)構(gòu)類似物和其他常見獸藥均不產(chǎn)生交叉反應(yīng),特異性良好。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R155.5
【部分圖文】：

圖 2.1 金剛烷胺人工抗原合成過程Figure 2.1 Synthesis process of AMD artificial antigen2.3.2 金剛烷胺人工抗原的純化為除去偶聯(lián)過程中的鹽類、未反應(yīng)的小分子和其他小分子雜質(zhì)，需對人工抗原進行透析。剪取適當(dāng)長度截留分子量為 8000~14000 kDa 的透析袋，每袋裝入 2 mL液體并用透析夾封口。放入盛有 400 mL透析磷酸鹽緩沖液的燒杯中，將燒杯置于磁力攪拌器上，在 4℃條件下，每 6 小時換液一次，透析三天后將袋中液體取出保存。2.3.3 金剛烷胺抗原的表征將所得的半抗原產(chǎn)物取少量配制成適宜濃度，另配制 10 μg/mL AMD 標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為參照，將兩種樣本進行質(zhì)譜解析，分析譜圖。將人工抗原取少量配制成適宜濃度，另配制 10 μg/mL AMD 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，1% OVA溶液，對三種樣本進行紫外-可見光譜掃描，并分析光譜圖。

第二章 金剛烷胺人工抗原合成及單克隆抗體制備2.4 結(jié)果與討論2.4.1 金剛烷胺抗原的鑒定AMD 的相對分子質(zhì)量為 151.25，質(zhì)譜解析如圖 2.2 A，在（m/z）=152.2 處出現(xiàn)的分子離子峰，符合 AMD M+1 的準(zhǔn)分子離子峰。（m/z）=135.1 處出現(xiàn)的分子離子峰推測為 AMD 上的氨基斷裂后的橋環(huán)結(jié)構(gòu)的特征峰。同理，圖 2.2 B中 AMD 半抗原的相對分子質(zhì)量為 265.2，在譜圖上可以看出，（m/z）=266.2 處有較強分子離子峰，（m/z）=152.2 處未出現(xiàn)象征 AMD 結(jié)構(gòu)的分子離子峰，可以推斷出 AMD半抗原結(jié)構(gòu)已成功合成。

13圖 2.3 AMD-OVA 的紫外-可見光譜Figure 2.3 UV-Vis spectrum characterization of AMD-OVA2.4.2 抗血清的性能評價自二免開始，每次免疫后三天對小鼠斷尾取血測效價，以此類推，收集數(shù)據(jù)繪制免疫應(yīng)答曲線。由圖 2.4和 2.5可知，利用 AMD-BSA 免疫的三只小鼠在五免后效價均嚴重下降，不足 4000，不能進行后期的細胞融合；利用 AMD-OVA免疫的三只小鼠中雖然 2 號小鼠的抗血清效價較高，但對其進行抑制情況的測定時（圖 2.6），加入 100 ng/mL AMD標(biāo)準(zhǔn)品，抑制率仍不足 20%，因此也無法用于單克隆抗體的制備。
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本文編號：2836760