發(fā)布時間：2020-09-30 01:46

　　 目的本研究通過建立體外大鼠II型肺泡上皮細胞(RLE-6TN),運用相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù),觀察百草枯(paraquat,PQ)是否能誘導(dǎo)RLE-6TN細胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)現(xiàn)象;探討MAPK蛋白家族是否參與PQ致肺泡上皮細胞EMT;最后闡明JNK/AP-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在百草枯誘導(dǎo)肺泡上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的調(diào)控機制。方法建立大鼠II型肺泡上皮細胞(RLE-6TN)體外模型1.探求PQ對RLE-6TN細胞損害的劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系。以終濃度為0、25、50、100、200、300、400μmol/L PQ染毒細胞24h,CCK-8法檢測細胞存活率,觀察不同濃度PQ對細胞的損傷程度;使用終濃度200μmol/L PQ處理細胞12、24、36、48、60、72h,CCK-8法檢測細胞存活率,觀察PQ在不同時間點對細胞的損傷程度;以200μmol/L PQ處理細胞不同時間(12、24、36h),運用流式細胞儀Annexin V-FITC法檢測細胞凋亡;PI單染法檢測細胞周期。2.觀察不同濃度或不同時間PQ染毒RLE-6TN細胞后,細胞形態(tài)、細胞的生物行為學(xué)和上皮/間質(zhì)標志物表達變化的情況。以200μmol/L PQ處理細胞不同時間(12、24、36h),細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力;Transwell小室法檢測細胞侵襲能力;免疫熒光檢測細胞上皮/間質(zhì)標志物蛋白表達改變。以終濃度為0、25、50、100μmol/L PQ染毒細胞不同時間(6、12、24h),運用免疫印跡檢測上皮細胞標志物E-cad、ZO-1和間質(zhì)標志物蛋白α-SMA、Vimentin的表達水平。3.為了觀察PQ染毒對MAPK蛋白家族的關(guān)鍵蛋白的影響,將RLE-6TN細胞分成五組:正常對照組(control)、100μmol/L PQ染毒組、100μmol/L PQ與p38MAPK抑制劑聯(lián)合干預(yù)組、100μmol/L PQ與JNK抑制劑聯(lián)合干預(yù)組、100μmol/L PQ與Erk抑制劑聯(lián)合干預(yù)組。運用免疫印跡檢測p38MAPK、JNK、Erk1/2蛋白表達及磷酸化表達水平變化。4.探討JNK/AP-1信號通路是否參與了PQ誘導(dǎo)RLE-6TN細胞發(fā)生的EMT。終濃度0、100、200、300μmol/L PQ誘導(dǎo)RLE-6TN細胞24 h,運用免疫印跡檢測JNK/AP-1信號通路關(guān)鍵蛋白JNK、c-jun、c-fos及其磷酸化蛋白p-JNK、p-c-jun、p-c-fos表達的變化;采用雙熒光素酶報告基因檢測PQ誘導(dǎo)RLE-6TN細胞中AP-1轉(zhuǎn)錄活性。5.尋找JNK/AP-1信號通路的有效靶點,探討JNK抑制劑SP600125能否成為PQ中毒致纖維化治療的新靶點。將10μmol/L SP600125在加入PQ前孵育細胞2h,通過CCK-8篩選對細胞無損害的濃度劑量,運用免疫印跡檢測細胞p-JNK表達水平來判斷是否有效抑制JNK磷酸化水平。使用流式細胞儀Annexin V-FITC法檢測干預(yù)前后細胞凋亡的改變;細胞劃痕實驗檢測干預(yù)前后細胞遷移能力;運用免疫印跡檢測細胞干預(yù)前后JNK/AP-1信號通路的相關(guān)蛋白表達水平,并檢測上皮細胞標志物E-cad、ZO-1和間質(zhì)標志物α-SMA、Vimentin的表達水平;采用RT-PCR檢測干預(yù)前后細胞的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、COL-I、COL-III mRNA表達水平。結(jié)果(1)與對照組比較,RLE-6TN細胞存活率隨著PQ劑量和時間的增加明顯降低(P0.05),呈劑量和時間依賴性。與對照組比較,以200μmol/L PQ誘導(dǎo)RLE-6TN細胞12、24、36h,細胞凋亡率下降(P0.05),細胞周期阻滯在S期(P0.05);(2)與對照組比較,以200μmol/L PQ誘導(dǎo)RLE-6TN細胞12、24、36h,細胞形態(tài)表現(xiàn)為卵圓形、連接緊密的上皮細胞向紡錘狀梭形、連接松散的間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變;RLE-6TN細胞的遷移能力增強(P0.05);RLE-6TN細胞的侵襲能力增強(P0.05);上皮標志物E-cad熒光強度減弱,間質(zhì)標志物FSP-1熒光強度增加;以終濃度為0、25、50、100μmol/L PQ染毒細胞6、12、24h,上皮細胞標記蛋白E-cad、ZO-1表達下調(diào),間質(zhì)標志物蛋白α-SMA、Vimentin的表達上調(diào)(P0.05);(3)與對照組比較,100μmol/L PQ誘導(dǎo)細胞24h后,RLE-6TN細胞p-p38MAPK、p-JNK、p-Erk1/2蛋白表達明顯上調(diào)(P0.05)。與PQ誘導(dǎo)組比較,干預(yù)組(分別用p38MAPK特異抑制劑SB203580、JNK特異抑制劑SP600125、Erk特異抑制劑PD98059)各10μmol/L預(yù)處理1h,100μmol/L PQ處理24h)的上述蛋白磷酸化水平均明顯降低(P0.05)。(4)與對照組比較,PQ能夠誘導(dǎo)p-JNK、p-c-jun、p-c-fos蛋白表達明顯上調(diào)(P0.05);染毒組的AP-1轉(zhuǎn)錄激活較對照組顯著增強(P0.05);(5)1、10μmol/L SP600125組的細胞存活率下降不明顯(P0.05),100μmol/L組能明顯的抑制細胞增殖活性(P0.05),10μmol/L SP600125組在誘導(dǎo)細胞2h后吸出繼續(xù)培養(yǎng)12、24h,該組細胞存活率下降不明顯(P0.05),10μmol/L SP600125組在誘導(dǎo)細胞2h后吸出繼續(xù)培養(yǎng)36h,能明顯的抑制細胞增殖活性(P0.05);10μmol/L SP600125組能夠明顯抑制PQ誘導(dǎo)的JNK蛋白磷酸化水平;與染毒組比較,在12、24、36h時間點,干預(yù)組的細胞存活率明顯降低(P0.05),在48h時間點,干預(yù)組的存活率無明顯變化(P0.05);與PQ染毒組相比,干預(yù)組凋亡降低,但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),干預(yù)組細胞遷移能力明顯降低(P0.05);與染毒組比較,干預(yù)組能夠有效抑制p-JNK、p-c-jun、p-c-fos蛋白表達(P0.05);與染毒組相比,干預(yù)組的上皮標志物表達明顯升高(P0.05),而間質(zhì)標志物表達明顯降低(P0.05);與染毒組比較,干預(yù)組的COL-1和COL-III mRNA表達顯著降低(P0.05),另外兩大成分基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/MMP-9 mRNA表達也明顯降低(P0.05),TIMP1mRNA表達也明顯升高(P0.05)結(jié)論MAPK信號通路的激活在PQ誘導(dǎo)RLE-6TN細胞發(fā)生EMT中發(fā)揮重要作用;JNK作為JNK/AP-1信號通路的上游靶點執(zhí)行了EMT進程;SP600125可能是治療PQ中毒致逆轉(zhuǎn)EMT的關(guān)鍵靶點。
【學(xué)位單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

108h 之后到達平臺期，細胞死亡數(shù)量逐漸增加，第 144h 出現(xiàn)細胞接觸抑制現(xiàn)象(圖1A)。正常 RLE-6TN 細胞表現(xiàn)為由卵圓形、連接緊密的上皮細胞(圖 1-1B)。2.2 PQ 誘導(dǎo) RLE-6TN 細胞增殖活性降低CCK-8 結(jié)果顯示，不同終濃度 PQ(0、25、50、100、200、300、400μmol/L)處理細胞 24h，細胞存活率隨著染毒濃度的增加而下降，與對照組比較，50、100、200、300、400 μmol/L PQ 染毒組的細胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)（圖 1-2A）。說明 PQ 對 RLE-6TN 細胞的損傷具有劑量依賴性(r=㧟0.953)，染毒濃度越大，對細胞的損傷越強。以 200 μmol/LPQ 處理細胞不同時間(12、24、36、48、60、72h)，細胞存活率隨染毒時間的增加而下降，與對照組比較，PQ 染毒 24、36、48、60、72h 細胞存活率明顯下降(P<0.05)。提示隨著染毒時間的延長，PQ 對 RLE-6TN 細胞的毒性增強(r=㧟0.921)(圖1-2B)。圖 1-1 正常的 RLE-6TN 細胞生長曲線及形態(tài)學(xué)特征注：A:RLE-6TN 細胞生長曲線；B:RLE-6TN 細胞形態(tài)學(xué)特征(×200)

108h 之后到達平臺期，細胞死亡數(shù)量逐漸增加，第 144h 出現(xiàn)細胞接觸抑制現(xiàn)象(圖1A)。正常 RLE-6TN 細胞表現(xiàn)為由卵圓形、連接緊密的上皮細胞(圖 1-1B)。2.2 PQ 誘導(dǎo) RLE-6TN 細胞增殖活性降低CCK-8 結(jié)果顯示，不同終濃度 PQ(0、25、50、100、200、300、400μmol/L)處理細胞 24h，細胞存活率隨著染毒濃度的增加而下降，與對照組比較，50、100、200、300、400 μmol/L PQ 染毒組的細胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)（圖 1-2A）。說明 PQ 對 RLE-6TN 細胞的損傷具有劑量依賴性(r=㧟0.953)，染毒濃度越大，對細胞的損傷越強。以 200 μmol/LPQ 處理細胞不同時間(12、24、36、48、60、72h)，細胞存活率隨染毒時間的增加而下降，與對照組比較，PQ 染毒 24、36、48、60、72h 細胞存活率明顯下降(P<0.05)。提示隨著染毒時間的延長，PQ 對 RLE-6TN 細胞的毒性增強(r=㧟0.921)(圖1-2B)。圖 1-1 正常的 RLE-6TN 細胞生長曲線及形態(tài)學(xué)特征注：A:RLE-6TN 細胞生長曲線；B:RLE-6TN 細胞形態(tài)學(xué)特征(×200)

2.2 PQ 誘導(dǎo) RLE-6TN 細胞遷移能力增強采用細胞劃痕實驗檢測 PQ 對 RLE-6TN 細胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，與組比較，200μmol/LPQ 誘導(dǎo)組的細胞遷移能力明顯增強(圖 2-2A)，尤其是 24h 誘導(dǎo)細胞劃痕明顯變窄、36h 誘導(dǎo)組的細胞劃痕基本被遷移過來的細胞所覆蓋，而對照劃痕則明顯存在，且這種改變具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖 2-2B)。提示隨著 PQ 誘導(dǎo)的延長，RLE-6TN 細胞的遷移能力增強。

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本文編號：2830567