本文關(guān)鍵詞：秀麗線蟲細胞色素b5及其還原酶調(diào)控多不飽和脂肪酸的合成，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是許多細胞及生理活動中非常重要的成分,機體多不飽和脂肪酸的平衡影響著生物體正常的生理功能。哺乳動物體內(nèi)合成多不飽和脂肪酸實際上是一個耗氧的過程,飽和脂肪酸在一系列酶諸如細胞色素b5、黃素蛋白-NADH-依賴型細胞色素b5還原酶(Ncb5or)和脂肪酸去飽和酶等蛋白的共同作用下形成多不飽和脂肪酸。已有研究表明在小鼠、利什曼原蟲和擬南芥中,特定的脂肪酸合成缺陷與細胞色素b5還原酶或者與細胞色素b5相關(guān),但對NADH-細胞色素b5還原酶、細胞色素b5、硬脂酰輔酶A去飽和酶以及其他的去飽和酶之間的相互關(guān)系還未曾報道。在秀麗線蟲多不飽和脂肪酸合成過程中NADH--細胞色素b5還原酶和細胞色素b5是以哪種形式的存在并發(fā)揮著作用還不清楚,也不知道秀麗線蟲中從FAT-1～FAT-7的脂肪酸去飽和酶在去飽和作用過程中是否需要NADH-細胞色素b5還原酶和細胞色素b5的共同參與來激活并發(fā)揮功能?本研究以秀麗線蟲作為模式生物,通過分子生物學和遺傳學方法探索屬于P450酶系超家族基因的NADH-細胞色素b5還原酶和細胞色素b5影響多不飽和脂肪酸合成的具體機制。運用RNA干擾抑制基因表達的方法來抑制NADH-細胞色素b5還原酶和細胞色素b5的基因,并將提取的脂肪酸采用氣相色譜來檢測脂肪酸成分的變化。利用薄層色譜-氣相色譜連用的方法檢測秀麗線蟲脂肪含量的變化。本研究還運用熒光實時定量PCR檢測秀麗線蟲相關(guān)脂肪酸合成與分解關(guān)鍵基因的表達量及用基因過表達綠色熒光蛋白的熒光強度檢測蛋白表達水平。并利用外源添加所缺脂肪酸的方法來緩解其缺陷的表型。在本研究中,尋找到NADH-依賴型細胞色素b5還原酶和細胞色素b5,以及他們在秀麗線蟲不同的去飽和酶活性功能發(fā)揮過程中所起的作用。本研究發(fā)現(xiàn)線蟲中NADH-細胞色素b5還原酶的同源基因為T05H4.4、hpo-19;細胞色素b5的同源基因為cytb-5.1。三個基因功能缺失后,線蟲脂肪酸成分發(fā)生顯著的變化。hpo-19和cytb-5.1干擾株脂滴變小、產(chǎn)卵減少、多不飽和脂肪酸含量和脂肪儲存量減少。另外,抑制hpo-19導致生長發(fā)育變緩,抑制cytb-5.1導致壽命縮短等多種表型。在脂肪酸去飽和酶基因表達的研究過程中,hpo-19和cytb-5.1明顯使fat-2、fat-6和fat-7上調(diào)。外源補充所缺脂肪酸緩解其缺陷發(fā)現(xiàn)當hp0-19添加C18:3n3、C18:3n6和C20：4n6時,其下游產(chǎn)物都可以部分恢復,但添加C20：3n6時,其下游產(chǎn)物C20：4n6沒有任何恢復。而cytb-5.1外源加入C18:1n9、C18:2n6、C18:3n3、C18:3n6、C20:3n6和C20：4n6等六種脂肪酸時,都能將其下游產(chǎn)物的脂肪酸和生長表型等恢復。細胞色素b5 (CYTB5.1)主要與硬脂酰輔酶A去飽和酶(FAT-6、FAT-7)共同作用調(diào)控脂肪酸合成,而細胞色素b5還原酶(HPO-19)與FAT-1、FAT-2、FAT-3和FAT-4共同作用,主要與FAT-2和FAT-4共同作用調(diào)節(jié)秀麗線蟲多不飽和脂肪酸的合成。
【關(guān)鍵詞】：NADH-細胞色素b5還原酶 細胞色素b5 脂肪酸去飽和酶 多不飽和脂肪酸 秀麗線蟲
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R151.2
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-10
• 第一章 前言10-19
• 1 多不飽和脂肪酸的研究進展10-12
• 1.1 脂肪10
• 1.2 脂肪酸的分類10
• 1.3 多不飽和脂肪酸分類及來源10-11
• 1.4 多不飽和脂肪酸的功能11
• 1.5 秀麗線蟲多不飽和脂肪酸的合成11-12
• 2 細胞色素b5及其還原酶研究進展12-14
• 2.1 細胞色素P45012-13
• 2.2 細胞色素b5及還原酶13
• 2.3 細胞色素b5及還原酶在多不飽和脂肪酸形成過程中的作用13-14
• 3 硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)研究進展14-15
• 4 秀麗線蟲作為模式生物的優(yōu)勢15-16
• 4.1 秀麗線蟲生物學特征15
• 4.2 秀麗線蟲作為脂類代謝模式生物的優(yōu)勢15-16
• 5 脂滴的概述16-17
• 6 本課題研究意義17-19
• 第二章 hpo-19、T05H4.4和cytb5.1功能缺陷對秀麗線蟲脂肪酸成分的影響19-29
• 1 材料、試劑、儀器和方法19-23
• 1.1 材料19
• 1.1.1 秀麗線蟲19
• 1.1.2 干擾基因(附表1)19
• 1.1.3 大腸桿菌(E. coli)19
• 1.2 試劑19-20
• 1.3 儀器20-21
• 1.4 溶液配制21
• 1.5 實驗方法21-23
• 1.5.1 秀麗線蟲的培養(yǎng)21-22
• 1.5.2 氣相色譜法檢測秀麗線蟲脂肪酸成分的變化22-23
• 1.6 統(tǒng)計分析方法23
• 2 結(jié)果與分析23-28
• 2.1 脂肪酸成分及含量23-28
• 3 本章小結(jié)28-29
• 第三章 hpo-19、T05H4.4和cytb5.1對PUFAs合成相關(guān)基因與蛋白表達的影響29-36
• 1 材料、試劑、儀器和方法29-32
• 1.1 材料29-30
• 1.1.1 秀麗線蟲29
• 1.1.2 干擾基因29-30
• 1.1.3 大腸桿菌(E.coli)30
• 1.2 試劑30
• 1.3 儀器30
• 1.4 溶液配制30
• 1.5 實驗方法30-32
• 1.5.1 秀麗線蟲總RNA提取30-31
• 1.5.2 秀麗線蟲總RNA的反轉(zhuǎn)錄31
• 1.5.3 熒光定量PCR檢測基因的表達量31
• 1.5.4 綠色熒光蛋白表達量的檢測31-32
• 1.6 統(tǒng)計分析方法32
• 2 結(jié)果與分析32-35
• 2.1 RNA干擾效果的檢測32
• 2.2 脂肪酸合成相關(guān)基因表達量檢測32-34
• 2.3 脂肪酸去飽和酶蛋白表達量檢測34-35
• 3 本章小結(jié)35-36
• 第四章 外源脂肪酸對線蟲PUFAs合成缺陷的恢復作用36-45
• 1 材料、試劑、儀器和方法36-37
• 1.1 材料36
• 1.2 試劑36
• 1.3 儀器36
• 1.4 溶液配制36-37
• 1.5 實驗方法37
• 1.6 統(tǒng)計分析方法37
• 2 結(jié)果與分析37-44
• 2.1 秀麗線蟲的食物(E. coli)對外援脂肪酸的吸收37
• 2.2 外源脂肪酸對秀麗線蟲PUFAs合成缺陷的緩解作用37-44
• 3 本章小結(jié)44-45
• 第五章 hpo-19、T05H4.4和cytb5.1功能缺失對線蟲脂肪含量、生長發(fā)育、生殖能力等表型的影響45-53
• 1 材料、試劑、儀器和方法45-47
• 1.1 材料45
• 1.2 試劑45
• 1.3 儀器45
• 1.4 溶液配制45-46
• 1.5 實驗方法46-47
• 1.5.1 尼羅紅固定染色46
• 1.5.2 量化秀麗線蟲脂滴直徑46
• 1.5.3 薄層色譜-氣相色譜檢測秀麗線蟲脂肪含量的變化46-47
• 1.5.4 生長發(fā)育47
• 1.6 統(tǒng)計分析方法47
• 2 結(jié)果與分析47-51
• 2.1 TO5H4.4、hpo-19和cytb5.1功能缺失后對脂滴的影響47-49
• 2.2 TO5H4.4、hpo-19和cytb5.1功能缺失后對脂肪含量的影響49-50
• 2.3 TO5H4.4、hpo-19和cytb5.1功能缺失后對生長發(fā)育的影響50-51
• 3 本章小結(jié)51-53
• 討論與結(jié)論53-56
• 參考文獻56-63
• 附表63-68
• 致謝68-69
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄69-70

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本文編號：282919