目的:尼古丁能夠通過nAChR-α7調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞發(fā)育,參與神經(jīng)發(fā)生,同時由cAMP調(diào)節(jié)的鳥嘌呤核苷酸直接激活的交換因子(EPAC/cAMP-GEF)和PKA及其下游的信號分子也介導神經(jīng)細胞增殖和分化、神經(jīng)元軸突靶向生長。因此,我們研究尼古丁是否通過nAChR-α7介導EPAC及其相關信號分子的變化,從而調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)發(fā)育和神經(jīng)形成,為尼古丁暴露引起的神經(jīng)發(fā)育毒性提供合理的解釋和尋找治療的分子靶點。方法:1.用24小時內(nèi)C57/BL6的新生小鼠,分離海馬組織,培養(yǎng)原代小鼠海馬NSCs,細胞傳代至第3代第5天,進行免疫細胞化學染色,巢蛋白Nestin鑒定神經(jīng)干細胞、SOX2標志物鑒定神經(jīng)祖細胞、Ki-67檢測NSCs增殖率;第3代NSCs誘導分化,培養(yǎng)5天,DCX、Tuj1、MAP2、GFAP和S100β抗體進行免疫細胞化學染色鑒定分化能力。2.LDH毒性檢測法檢測不同濃度尼古丁(1,10,100,200,300和400 μM)對NSCs的毒性作用;不同尼古丁濃度處理細胞,CCK-8法測定尼古丁對NSCs活力影響;碘化丙啶染色,流式細胞儀檢測不同濃度尼古丁對NSCs細胞周期的影響;不同濃度尼古丁急性處理NSCs,提取蛋白,檢測p-p38MAPK、p38MAPK、pERK、ERK、pAKT、AKT、nAChR-α7、EPAC1、EPAC2、PKA、Rap1、p-CREB和CREB蛋白表達。3.第3代NSCs誘導分化,尼古丁持續(xù)處理7天,DCX和GFAP免疫細胞化學染色檢測尼古丁 10μM對NSCs分化能力的影響;提取蛋白,檢測DCX和GFAP蛋白表達;分別用尼古丁、EPAC激動劑8-CPT、EPAC抑制劑ESI-09、PKA激動劑6-BNZ、PKA抑制劑H-89、ESI-09聯(lián)合尼古丁以及H-89聯(lián)合尼古丁條件處理細胞,DCX染色分析不同處理條件后DCX+神經(jīng)元樹突分支數(shù)和軸突長度;提取 mRNA,qRT-PCR 檢測 nAChR-α7、EPC1、EPAC2、PKA 和 Rap1 mRNA 的表達。4.第3代NSCs誘導分化,分別用尼古丁 10μM、nAChR-α7特異性拮抗劑MLA 10μM以及MLA聯(lián)合尼古丁處理6小時,提取蛋白檢測nAChR-α7、EPC1、EPAC2、PKA和Rap1蛋白表達。結(jié)果:1.從小鼠海馬組織中成功分離NSCs,每隔3天進行傳代,細胞成球生長狀態(tài)良好;第3代細胞Nestin和SOX2染色陽性,Ki-67陽性細胞占比49%,NSCs具有分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的能力,DCX、Tuj1、MAP2、GFAP和S100β染色均呈陽性。2.尼古丁不同濃度(1,10,100,200,300和400μM)對NSCs無明顯細胞毒性;尼古丁對細胞活性的影響有劑量效應,中等濃度(100和200μM)明顯增加NSCs的細胞活性;尼古丁急性暴露促進小鼠海馬NSCs增殖,p-p38 MAPK/p38 MAPK、pERK/ERK和pAKT/AKT明顯上調(diào),上調(diào)nAchR-α7表達,上調(diào)pCREB/CREB比率。3.NSCs誘導分化,尼古丁增加DCX+神經(jīng)元細胞的數(shù)量,增加DCX蛋白表達,降低GFAP蛋白表達;尼古丁、EPAC和PKA激動劑降低神經(jīng)元樹突分支數(shù),縮短軸突長度,而EPAC和PKA抑制劑增加神經(jīng)元樹突分支數(shù)和軸突長度;EPAC、PKA抑制劑聯(lián)合尼古丁處理降低尼古丁對神經(jīng)元形態(tài)可塑性的影響。4NSCs誘導分化,nAChR-α7特異性抑制劑(MLA)下調(diào)nAChR-α7蛋白表達,及尼古丁介導的下游EPAC/Rap1信號,但對PKA蛋白表達沒有明顯影響。結(jié)論:本研究說明了尼古丁對體外培養(yǎng)的NSCs增殖和分化均有影響。在增殖培養(yǎng)條件下,急性尼古丁暴露激活P38-MAPK、ERK和AKT信號通路,最終影響NSCs的增殖;在分化培養(yǎng)條件下,nAChR-α7特異性抑制劑下調(diào)nAChR-α7蛋白表達,及尼古丁介導的下游EPAC/Rap1信號,提示尼古丁通過nAChR-α7影響EPAC/Rap1信號的變化,促進早期神經(jīng)元分化,影響神經(jīng)元可塑性,減少神經(jīng)元樹突分支和降低軸突長度。圖[12]表[0]參[52]
【學位單位】：安徽理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

圖３邋：邋ＮＳＣｓ分化能力檢測逡逑Ａ：未成熟神經(jīng)元標記物ＤＣＸ染色；逡逑Ｂ：成熟神經(jīng)元標記物ＭＡＰ２染色；逡逑Ｃ：ＧＦＡＰ

圖４：不同濃度尼古丁暴露對ＮＳＣｓ的細胞毒性和增殖的影響逡逑

圖５：尼古丁暴露對ＮＳＣｓ細胞周期的影響逡逑Ａ：對照組；逡逑Ｂ：尼古丁邋ｌ邋ｐＭ處理組；逡逑

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