目的:1.建立穩(wěn)定表達人源性ApoE4基因的PC12細胞株(PC12-ApoE4細胞)2.探討鋁作用于PC12-ApoE4細胞對其Aβ含量和ApoER2等LDLR家族表達變化的影響方法:1.將攜帶有人源性ApoE4基因重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染PC12細胞株,在熒光顯微鏡下觀察熒光強度,用嘌呤霉素進行篩選,獲得ApoE4穩(wěn)定過表達PC12細胞株(PC12-ApoE4細胞組)和陰性空載體對照PC12細胞株(PC12-NC細胞組)。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)分別檢測PC12細胞組、PC12-NC細胞組、PC12-ApoE4細胞組的R-ApoE和(或)H-ApoE-FLAG的mRNA相對表達量,以鑒定構(gòu)建細胞效果。2.實驗分為PC12細胞組[包括0μM Al(mal)_3組、100μM Al(mal)_3組、200μM Al(mal)_3組、400μM Al(mal)_3組],PC12-NC細胞組,PC12-ApoE4細胞組[包括ApoE4組、100μM Al(mal)_3+ApoE4組、200μM Al(mal)_3+ApoE4組、400μM Al(mal)_3+ApoE4組]。0μM Al(mal)_3組作為實驗對照組。麥芽酚鋁溶液處理24h后,采用CCK-8法檢測細胞存活率,收集各組細胞。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試驗檢測Aβ_(40)和Aβ_(42)含量,RT-PCR檢測APP,ApoER2,LRP1及VLDLRs基因表達,蛋白印跡(western-blot)法檢測APP,ApoER2,LRP1及VLDLRs蛋白表達。結(jié)果:1.慢病毒轉(zhuǎn)染24h后,PC12細胞組、PC12-NC細胞組、PC12-ApoE4細胞組在顯微鏡下觀察細胞的數(shù)量、形態(tài)、大小等均無明顯差異。PC12-ApoE4細胞組、PC12-NC細胞組熒光顯微鏡下均可見熒光表達,提示轉(zhuǎn)染成功;PC12細胞組未見熒光表達。PC12細胞組R-ApoE基因、PC12-NC細胞組R-ApoE基因、PC12-ApoE4細胞組H-ApoE-FLAG基因的m RNA的相對表達量的中位數(shù)分別為1.00、1.01、148.74,其中,PC12細胞組與PC12-NC細胞組R-ApoE基因的mRNA的相對表達量均低于PC12-ApoE4細胞組H-ApoE-FLAG基因(P0.01)。2.麥芽酚鋁染毒24h后,PC12細胞組和PC12-ApoE4細胞組,均隨著染毒劑量的增加,細胞數(shù)量減少,死亡細胞增多,胞體間的連接減少,細胞間變得松散,貼壁性降低,細胞變圓固縮,胞體有光暈。(1)細胞存活率:麥芽酚鋁染毒后,隨著染毒劑量的增加,PC12細胞組和PC12-ApoE4細胞組的細胞存活率均降低,均呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(P0.01),與0μM劑量組相比較,2種細胞200μM劑量組和400μM劑量組細胞存活率的降低均有統(tǒng)計學意義(P0.01);其中,細胞存活率在染毒劑量及細胞類型的主效應(yīng)以及交互效應(yīng)上均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(2)Aβ含量的變化:Aβ總量:與對照組相比較,PC12-NC細胞組、100μMAl(mal)_3組和ApoE4組Aβ總量的變化均無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.936,0.385,0.166),其他各染毒組Aβ總量的變化均有統(tǒng)計學意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,Aβ總量升高(P0.01);其中,在染毒劑量及細胞類型的主效應(yīng)及交互效應(yīng)上均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。Aβ_(40)含量:各組Aβ_(40)含量的變化無統(tǒng)計學意義(P=0.073);其中,染毒劑量的主效應(yīng)具有統(tǒng)計學意義(P=0.022),細胞類型的主效應(yīng)及染毒劑量與細胞類型的交互效應(yīng)上均無統(tǒng)計學意義(P=0.214,P=0.395)。Aβ_(42)含量:與對照組相比較,PC12-NC細胞組、100μM Al(mal)_3組和ApoE4組Aβ_(42)含量的變化均無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.945,0.339,0.440),其他各染毒組Aβ_(42)含量的變化均有統(tǒng)計學意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,Aβ_(42)含量升高(P0.01);其中,在染毒劑量及細胞類型的主效應(yīng)及交互效應(yīng)上均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(3)APP基因和蛋白的表達:與對照組相比較,PC12-NC細胞組APP基因和蛋白的表達均無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.925,0.722)�；�:與對照組相比較,ApoE4組APP基因的表達升高(P0.01),其他各染毒組均有統(tǒng)計學意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,APP基因的表達升高(P0.01);其中,在染毒劑量及細胞類型的主效應(yīng)有統(tǒng)計學意義(P0.01),交互效應(yīng)上無統(tǒng)計學意義(P=0.172)。蛋白:與對照組相比較,100μM Al(mal)_3組與ApoE4組均無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.077,0.226),其他各染毒組均有統(tǒng)計學意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,APP蛋白的表達升高(P0.01);其中,在染毒劑量及細胞類型的主效應(yīng)有統(tǒng)計學意義(P0.01),交互效應(yīng)上無統(tǒng)計學意義(P=0.980)。(4)ApoER2基因和蛋白的表達:與對照組相比較,PC12-NC細胞組ApoER2基因和蛋白的表達均無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.776,0.092)�；�:與對照組相比較,ApoE4組ApoER2基因的表達降低(P0.01),其他各染毒組均有統(tǒng)計學意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,ApoER2基因的表達降低(P0.01):其中,在染毒劑量及細胞類型的主效應(yīng)有統(tǒng)計學意義(P0.01),交互效應(yīng)上無統(tǒng)計學意義(P=0.202)。蛋白:與對照組相比較,100μM Al(mal)_3組、200μM Al(mal)_3組和ApoE4組無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.436,0.055,0.306),其他各染毒組ApoER2蛋白的表達有統(tǒng)計學意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,ApoER2蛋白的表達降低(P0.01);其中,在染毒劑量及細胞類型的主效應(yīng)及交互效應(yīng)上均有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.00,0.00,0.031)。(5)LRP1基因和蛋白的表達:與對照組相比較,PC12-NC細胞組與ApoE4組LRP1基因和蛋白的表達均無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.703,0.524,0.985,0.119)�；�:與對照組相比較,其他各染毒組均有統(tǒng)計學意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,LRP1基因的表達降低(P0.01);其中,在染毒劑量及細胞類型的主效應(yīng)有統(tǒng)計學意義(P0.01),交互效應(yīng)上無統(tǒng)計學意義(P=0.144)。蛋白:與對照組相比較,100μMAl(mal)_3組無統(tǒng)計學意義(P=0.587),其他各染毒組LRP1蛋白的表達均有統(tǒng)計學意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,LRP1蛋白的表達降低(P0.01);其中,在染毒劑量及細胞類型的主效應(yīng)及交互效應(yīng)上均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(6)VLDLRs基因和蛋白的表達:與對照組相比較,PC12-NC細胞組與ApoE4組VLDLRs基因和蛋白的表達均無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.730,0.148,0.925,0.484)�；�:與對照組相比較,其他各染毒組均有統(tǒng)計學意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,VLDLRs基因的表達降低(P0.01);其中,在染毒劑量及細胞類型的主效應(yīng)有統(tǒng)計學意義(P0.01),交互效應(yīng)上無統(tǒng)計學意義(P=0.384)。蛋白:與對照組相比較,100μMAl(mal)_3組與100μM Al(mal)_3+ApoE4組均無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.271,0.151),其他各染毒組均有統(tǒng)計學意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,VLDLRs蛋白的表達降低(P0.01);其中,在染毒劑量的主效應(yīng)有統(tǒng)計學意義(P0.01),細胞類型及交互效應(yīng)上無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.245,0.987)。結(jié)論:1.成功構(gòu)建穩(wěn)定表達人源性ApoE4基因的PC12細胞株。2.麥芽酚鋁和ApoE4基因?qū)C12細胞存活率的影響存在交互作用,ApoE4基因可增強麥芽酚鋁對PC12細胞的細胞毒性。3.麥芽酚鋁和ApoE4基因?qū)C12細胞Aβ含量變化的影響存在交互作用,尤其是Aβ_(42)含量的變化,ApoE4基因可增強麥芽酚鋁對PC12細胞Aβ含量升高的影響。4.麥芽酚鋁和ApoE4基因共同作用對PC12細胞Aβ含量升高的影響可能與二者共同作用對ApoER2及同家族LRP1蛋白的表達下調(diào)有關(guān)。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

嘌呤霉素篩選第2天PC12細胞狀態(tài)（倒置顯微鏡，×100）

A~F 嘌呤霉素的質(zhì)量濃度分別為 0、2、4、6、8、10 mg/L。圖 2 嘌呤霉素篩選第 3 天 PC12 細胞狀態(tài)（倒置顯微鏡，×100）2 細胞數(shù)量-時間曲線

PC12細胞數(shù)量-時間曲線

【參考文獻】

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本文編號：2817677