目的:1.建立穩(wěn)定表達(dá)人源性ApoE4基因的PC12細(xì)胞株(PC12-ApoE4細(xì)胞)2.探討鋁作用于PC12-ApoE4細(xì)胞對(duì)其Aβ含量和ApoER2等LDLR家族表達(dá)變化的影響方法:1.將攜帶有人源性ApoE4基因重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞株,在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度,用嘌呤霉素進(jìn)行篩選,獲得ApoE4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PC12細(xì)胞株(PC12-ApoE4細(xì)胞組)和陰性空載體對(duì)照PC12細(xì)胞株(PC12-NC細(xì)胞組)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)分別檢測(cè)PC12細(xì)胞組、PC12-NC細(xì)胞組、PC12-ApoE4細(xì)胞組的R-ApoE和(或)H-ApoE-FLAG的mRNA相對(duì)表達(dá)量,以鑒定構(gòu)建細(xì)胞效果。2.實(shí)驗(yàn)分為PC12細(xì)胞組[包括0μM Al(mal)_3組、100μM Al(mal)_3組、200μM Al(mal)_3組、400μM Al(mal)_3組],PC12-NC細(xì)胞組,PC12-ApoE4細(xì)胞組[包括ApoE4組、100μM Al(mal)_3+ApoE4組、200μM Al(mal)_3+ApoE4組、400μM Al(mal)_3+ApoE4組]。0μM Al(mal)_3組作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。麥芽酚鋁溶液處理24h后,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,收集各組細(xì)胞。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試驗(yàn)檢測(cè)Aβ_(40)和Aβ_(42)含量,RT-PCR檢測(cè)APP,ApoER2,LRP1及VLDLRs基因表達(dá),蛋白印跡(western-blot)法檢測(cè)APP,ApoER2,LRP1及VLDLRs蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.慢病毒轉(zhuǎn)染24h后,PC12細(xì)胞組、PC12-NC細(xì)胞組、PC12-ApoE4細(xì)胞組在顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)、大小等均無(wú)明顯差異。PC12-ApoE4細(xì)胞組、PC12-NC細(xì)胞組熒光顯微鏡下均可見(jiàn)熒光表達(dá),提示轉(zhuǎn)染成功;PC12細(xì)胞組未見(jiàn)熒光表達(dá)。PC12細(xì)胞組R-ApoE基因、PC12-NC細(xì)胞組R-ApoE基因、PC12-ApoE4細(xì)胞組H-ApoE-FLAG基因的m RNA的相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)分別為1.00、1.01、148.74,其中,PC12細(xì)胞組與PC12-NC細(xì)胞組R-ApoE基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量均低于PC12-ApoE4細(xì)胞組H-ApoE-FLAG基因(P0.01)。2.麥芽酚鋁染毒24h后,PC12細(xì)胞組和PC12-ApoE4細(xì)胞組,均隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞數(shù)量減少,死亡細(xì)胞增多,胞體間的連接減少,細(xì)胞間變得松散,貼壁性降低,細(xì)胞變圓固縮,胞體有光暈。(1)細(xì)胞存活率:麥芽酚鋁染毒后,隨著染毒劑量的增加,PC12細(xì)胞組和PC12-ApoE4細(xì)胞組的細(xì)胞存活率均降低,均呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(P0.01),與0μM劑量組相比較,2種細(xì)胞200μM劑量組和400μM劑量組細(xì)胞存活率的降低均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);其中,細(xì)胞存活率在染毒劑量及細(xì)胞類(lèi)型的主效應(yīng)以及交互效應(yīng)上均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(2)Aβ含量的變化:Aβ總量:與對(duì)照組相比較,PC12-NC細(xì)胞組、100μMAl(mal)_3組和ApoE4組Aβ總量的變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.936,0.385,0.166),其他各染毒組Aβ總量的變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,Aβ總量升高(P0.01);其中,在染毒劑量及細(xì)胞類(lèi)型的主效應(yīng)及交互效應(yīng)上均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。Aβ_(40)含量:各組Aβ_(40)含量的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.073);其中,染毒劑量的主效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022),細(xì)胞類(lèi)型的主效應(yīng)及染毒劑量與細(xì)胞類(lèi)型的交互效應(yīng)上均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.214,P=0.395)。Aβ_(42)含量:與對(duì)照組相比較,PC12-NC細(xì)胞組、100μM Al(mal)_3組和ApoE4組Aβ_(42)含量的變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.945,0.339,0.440),其他各染毒組Aβ_(42)含量的變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,Aβ_(42)含量升高(P0.01);其中,在染毒劑量及細(xì)胞類(lèi)型的主效應(yīng)及交互效應(yīng)上均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(3)APP基因和蛋白的表達(dá):與對(duì)照組相比較,PC12-NC細(xì)胞組APP基因和蛋白的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.925,0.722)�；�:與對(duì)照組相比較,ApoE4組APP基因的表達(dá)升高(P0.01),其他各染毒組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,APP基因的表達(dá)升高(P0.01);其中,在染毒劑量及細(xì)胞類(lèi)型的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),交互效應(yīng)上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.172)。蛋白:與對(duì)照組相比較,100μM Al(mal)_3組與ApoE4組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.077,0.226),其他各染毒組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,APP蛋白的表達(dá)升高(P0.01);其中,在染毒劑量及細(xì)胞類(lèi)型的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),交互效應(yīng)上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.980)。(4)ApoER2基因和蛋白的表達(dá):與對(duì)照組相比較,PC12-NC細(xì)胞組ApoER2基因和蛋白的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.776,0.092)。基因:與對(duì)照組相比較,ApoE4組ApoER2基因的表達(dá)降低(P0.01),其他各染毒組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,ApoER2基因的表達(dá)降低(P0.01):其中,在染毒劑量及細(xì)胞類(lèi)型的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),交互效應(yīng)上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.202)。蛋白:與對(duì)照組相比較,100μM Al(mal)_3組、200μM Al(mal)_3組和ApoE4組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.436,0.055,0.306),其他各染毒組ApoER2蛋白的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,ApoER2蛋白的表達(dá)降低(P0.01);其中,在染毒劑量及細(xì)胞類(lèi)型的主效應(yīng)及交互效應(yīng)上均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.00,0.00,0.031)。(5)LRP1基因和蛋白的表達(dá):與對(duì)照組相比較,PC12-NC細(xì)胞組與ApoE4組LRP1基因和蛋白的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.703,0.524,0.985,0.119)�；�:與對(duì)照組相比較,其他各染毒組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,LRP1基因的表達(dá)降低(P0.01);其中,在染毒劑量及細(xì)胞類(lèi)型的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),交互效應(yīng)上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.144)。蛋白:與對(duì)照組相比較,100μMAl(mal)_3組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.587),其他各染毒組LRP1蛋白的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,LRP1蛋白的表達(dá)降低(P0.01);其中,在染毒劑量及細(xì)胞類(lèi)型的主效應(yīng)及交互效應(yīng)上均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(6)VLDLRs基因和蛋白的表達(dá):與對(duì)照組相比較,PC12-NC細(xì)胞組與ApoE4組VLDLRs基因和蛋白的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.730,0.148,0.925,0.484)�；�:與對(duì)照組相比較,其他各染毒組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,VLDLRs基因的表達(dá)降低(P0.01);其中,在染毒劑量及細(xì)胞類(lèi)型的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),交互效應(yīng)上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.384)。蛋白:與對(duì)照組相比較,100μMAl(mal)_3組與100μM Al(mal)_3+ApoE4組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.271,0.151),其他各染毒組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為隨著染毒劑量的增加,VLDLRs蛋白的表達(dá)降低(P0.01);其中,在染毒劑量的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),細(xì)胞類(lèi)型及交互效應(yīng)上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.245,0.987)。結(jié)論:1.成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人源性ApoE4基因的PC12細(xì)胞株。2.麥芽酚鋁和ApoE4基因?qū)C12細(xì)胞存活率的影響存在交互作用,ApoE4基因可增強(qiáng)麥芽酚鋁對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性。3.麥芽酚鋁和ApoE4基因?qū)C12細(xì)胞Aβ含量變化的影響存在交互作用,尤其是Aβ_(42)含量的變化,ApoE4基因可增強(qiáng)麥芽酚鋁對(duì)PC12細(xì)胞Aβ含量升高的影響。4.麥芽酚鋁和ApoE4基因共同作用對(duì)PC12細(xì)胞Aβ含量升高的影響可能與二者共同作用對(duì)ApoER2及同家族LRP1蛋白的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R114
【部分圖文】：

嘌呤霉素篩選第2天PC12細(xì)胞狀態(tài)（倒置顯微鏡，×100）

A~F 嘌呤霉素的質(zhì)量濃度分別為 0、2、4、6、8、10 mg/L。圖 2 嘌呤霉素篩選第 3 天 PC12 細(xì)胞狀態(tài)（倒置顯微鏡，×100）2 細(xì)胞數(shù)量-時(shí)間曲線

PC12細(xì)胞數(shù)量-時(shí)間曲線

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2817677