[背景]胃腸炎是人類最常見疾病之一,主要臨床癥狀為惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛等,在免疫力低下的嬰幼兒和老年人群中�？梢鹈撍碗娊赓|(zhì)紊亂癥狀,是嬰幼兒和老年人住院或死亡的常見病因。目前引起人類胃腸炎的病原種類繁多,其中輪狀病毒(Rotavirus,RoV)、諾如病毒(Norovirus,NoV)和人星狀病毒(Human Astrovirus,HAstV)是導(dǎo)致人類病毒性胃腸炎的主要病原。RoV分為A～G 7組,其中A、B和C組可感染人類,A組RoV(RVA)更是引起全球范圍內(nèi)散發(fā)性胃腸炎的主要病毒;根據(jù)其VP4和VP7基因序列的不同,RVA至少可分為35個P基因型和27個G基因,其中G1～G4,P[8]和P[4]為主要流行型別。NoV在病毒性胃腸炎患者中檢出率僅次于RVA,是急性胃腸炎暴發(fā)的主要病原;根據(jù)VP1氨基酸序列的差異,NoV至少可分為7個基因組(GⅠ～GⅦ)和40個基因型,其中GⅠ、GⅡ和GⅣ可感染人類,導(dǎo)致胃腸炎發(fā)生;GⅡ.4每兩年左右便會出現(xiàn)新的變異株,并在人群中引起流行,是最重要的NoV基因型之一。HAstV在臨床病例中檢出率低于RVA和NoV,可分為8個血清型,其中HAstV-1為世界范圍內(nèi)主要流行型別。RVA、NoV和HAstV基因型別眾多,變異頻繁,在不同人群、不同地區(qū)、不同時間內(nèi)往往呈現(xiàn)不同的流行特征,對其開展監(jiān)測分析和分子流行病學(xué)研究,有助于采取有針對性的預(yù)防控制措施,進(jìn)而減少相關(guān)疾病負(fù)擔(dān)。目前國外病毒性胃腸炎的監(jiān)測仍然以基于醫(yī)院的臨床病例監(jiān)測為主,而環(huán)境污水監(jiān)測作為一種新興的病毒監(jiān)測方式,已在腸道病毒(Enterovirus,EV)分子流行病學(xué)研究中得到較好應(yīng)用。鑒于糞-口途徑為胃腸炎病毒的主要傳播方式,感染者體內(nèi)的病毒顆粒最終匯入城市污水處理廠,污水也就成為人類感染的重要來源。因此,胃腸炎病毒的環(huán)境污水監(jiān)測可作為其分子流行病學(xué)研究的重要補(bǔ)充。我國目前尚未建立完善的病毒性胃腸炎臨床病例監(jiān)測體系,有限的RVA、NoV和HAstV分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)只能從零散的病例報道中獲取,成為阻礙我國病毒性胃腸炎防控工作的瓶頸之一。而環(huán)境污水監(jiān)測作為一種獨立于臨床病例監(jiān)測之外的監(jiān)測途徑,不僅符合當(dāng)今公共衛(wèi)生領(lǐng)域提出的“同一個世界,同一個健康(One World,One Health)”的理念,也有望成為我國RVA、NoV和HAstV監(jiān)測和分子流行病學(xué)的重要研究方法。[目的]1.對環(huán)境污水中RVA、NoV和HAstV相關(guān)基因進(jìn)行擴(kuò)增和定型,確定2013～2016年度山東省監(jiān)測地區(qū)上述病毒型別分布和時間動態(tài)變化特征,構(gòu)建RVA、NoV和HAstV基因數(shù)據(jù)庫,為開展分子流行病學(xué)研究提供本底資料。2.對獲得的上述3種病毒序列開展系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究,探討監(jiān)測地區(qū)內(nèi)流行的RVA、NoV和HAstV與國內(nèi)外其他地區(qū)參考序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。3.分析山東省監(jiān)測地區(qū)RVA、NoV和HAstV優(yōu)勢型別序列基因重組情況及基因起源、進(jìn)化速度等進(jìn)化遺傳學(xué)特征。[方法]1.選擇山東省濟(jì)南、臨沂和煙臺3個市為監(jiān)測地區(qū),于2013～2016年采用定時采樣法,按月收集上述3個市污水處理廠入水口處環(huán)境污水標(biāo)本,并使用陰離子膜吸附洗脫法進(jìn)行濃縮富集。2.提取病毒核酸,采用特異性引物擴(kuò)增RVA、NoV和HAstV分子定型區(qū)基因片段,陽性產(chǎn)物經(jīng)回收純化、TA克隆后測序定型。3.使用BioEdit 7.1.9軟件,將本研究獲取序列與GenBank數(shù)據(jù)庫下載參考序列進(jìn)行比對,分析核苷酸和氨基酸同源性;采用Mega5.02軟件,計算序列間遺傳距離,并基于鄰接法(Neighbor-Joining Method)構(gòu)建RVA、NoV和HAstV山東序列和國內(nèi)外參考序列的系統(tǒng)發(fā)生樹,對本研究獲取的RVA、NoV和HAstV序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析。4.采用RDP 4.0軟件分析RVA、NoV和HAstV序列的重組情況。5.基于貝葉斯馬爾可夫鏈蒙特卡洛(Bayesian Markov Chain Monte Carlo,MCMC)方法,采用BEAST 1.7.5軟件對本研究獲取的RVA、NoV和HAstV序列進(jìn)行進(jìn)化遺傳學(xué)分析,估計其進(jìn)化速率、最近共同祖先起源時間(The Time To The Most Recent Common Ancestor,TMRCA)等進(jìn)化遺傳學(xué)特征。[結(jié)果]1.環(huán)境污水中RVA、NoV和HAstV的檢出情況2013～2016年,共收集上述3個市環(huán)境污水標(biāo)本132份,其中RVA G和P基因型檢出率分別為90.9%和89.4%,NoV GⅠ和GⅡ的檢出率分別為100.0%和97.0%,HAstV 檢出率為 81.8%。2.RVA、NoV和HAstV的基因型分布特征本研究共獲取RVA G基因序列758條,分屬G2、G3、G4、G6、G8、G9和G11共7個基因型,其中G9序列最多,占91.4%(693/758)。獲得的950條RVA P基因序列分屬 P[3]、P[4]、P[6]、P[8]、P[9]、P[14]和 P[23]共 7 個基因型,其中 P[8]和 P[4]為優(yōu)勢型別,分別占 53.7%(510/950)和 39.1%(371/950)。獲得的 1138 條 NoVGⅠ 基因序列分屬 GⅠ.1、GⅠ.2、GⅠ.3、GⅠ.4、GⅠ.5、GⅠ.6、GⅠ.8和GⅠ.9共8個基因型,其中GⅠ.6最多(占44.1%,502/1138),且2014年后,3個市主導(dǎo)基因型均由GⅠ.2轉(zhuǎn)換成GⅠ.6。886條NoV GⅡ基因序列分屬14個基因型,分別為 GⅡ.1、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.5、GⅡ.6、GⅡ.8、GⅡ.9、GⅡ.10、GⅡ.13、GⅡ.14、GⅡ.15、GⅡ.17 和 GⅡ.21,其中 GⅡ.17、GⅡ.3、GⅡ.4 和 GⅡ.6 為優(yōu)勢流行基因型,分別占 39.0%(345/886)、27.1%(240/886)、12.2%(108/886)和 8.7%(77/886)。獲得的526條HAstV基因序列分屬5個基因型,即HAstV-1～HAstV-5,其中HAstV-5最高(占45.4%,239/526),且在2015年后,3個市主導(dǎo)基因型呈現(xiàn)由HAstV-1向HAstV-5轉(zhuǎn)換趨勢。3.RVA、NoV和HAstV優(yōu)勢型別的同源性和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析從環(huán)境污水中獲取的RVAG9、P[8]和P[4]序列間同源性較低,系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析顯示上述基因型在監(jiān)測地區(qū)存在多個傳播鏈的共循環(huán)。NoV GⅠ.2序列間同源性較高,在系統(tǒng)發(fā)生樹上聚集為一簇,而GⅠ.6核酸和氨基酸差異大,系統(tǒng)發(fā)生樹顯示其分為2個進(jìn)化分支;NoV GⅡ.4序列屬于Den Haag 2006b和Sydney 2012變異株,但Den Haag 2006b變異株僅在2014年濟(jì)南市標(biāo)本中檢出;自2015年起,環(huán)境污水中檢出的GⅡ.17全部變?yōu)镵awasaki 2014變異株,提示這一新型變異株在當(dāng)?shù)氐牧餍?此外,我們還在2014年煙臺市標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)GⅡ.17 Hong Kong2015變異株。獲取的HAstV-1和HAstV-5序列之間核酸和氨基酸同源性同樣較低,且在當(dāng)?shù)卮嬖诙鄠�傳播鏈的共循環(huán)。4.重組分析本研究共檢出4條RVA重組序列,分別為G9型內(nèi)重組、P[8]型內(nèi)重組和P[4]/P[8]間重組。NoVGⅠ重組序列有11條,呈現(xiàn)6種重組形式,其中GⅠ.2/GⅠ.5重組序列最多;NoV GⅡ重組序列有3條,且只有GⅡ.3/GⅡ.6 一種重組形式。HAstV重組序列多達(dá)36條,其中HAstV-1/HAstV-5為最常見的重組組合。5.RVA、NoV和HAstV優(yōu)勢型別的進(jìn)化遺傳學(xué)分析進(jìn)化遺傳學(xué)分析結(jié)果顯示,G9序列起源時間為1970.6年,并以1.3×10-3s/s/y(Nucleotide Substitutions Per Site Per Year)速率進(jìn)化;P[8]的進(jìn)化速率大于 P[4],且擁有更早的起源時間。NoV GⅠ.6的進(jìn)化速率同樣大于GⅠ.2,且具有更早的起源時間;NoVGⅡ.4最近共同祖先起源于1983.4年,進(jìn)化速率為3.6×10-3s/s/y;GⅡ.17則起源于1956.5年,進(jìn)化速率為2.8×10-3s/s/y。本研究還首次報道了HAstV-1和HAstV-5進(jìn)化遺傳學(xué)特征,它們的起源時間分別為1960.4和1993年,進(jìn)化速率分別為1.3×10-3 s/s/y和4×10-3 s/s/y。[結(jié)論]1.本次研究監(jiān)測地區(qū)環(huán)境污水中RVA、NoV和HAstV序列的檢出率很高,提示上述病毒在監(jiān)測地區(qū)人群處于較高的流行強(qiáng)度。2.在本次研究的監(jiān)測地區(qū),G9、P[8]和P[4]為RVA主要G、P基因型;GⅠ.2、GⅠ.6 和 GⅡ.17、GⅡ.3、GⅡ.4 為 NoV GⅠ、GⅡ 優(yōu)勢基因型;HAstV-1 和 HAstV-5為HAstV優(yōu)勢型別。上述型別在監(jiān)測地區(qū)存在多個傳播鏈共循環(huán)現(xiàn)象。3.本次研究的監(jiān)測地區(qū),目前流行的NoV GⅡ.4變異株主要為Sydney 2012變異株,但2014年濟(jì)南市曾出現(xiàn)Den Haag2006b變異株流行,應(yīng)繼續(xù)監(jiān)測Den Haag 2006b變異株是否仍在當(dāng)?shù)亓餍小?015年后環(huán)境污水標(biāo)本中檢出的GⅡ.17全部變?yōu)镵awasaki 2014變異株,證實這一新型變異株在山東省監(jiān)測地區(qū)的流行。4.在本次研究期間,NoV GⅠ和HAstV的優(yōu)勢基因型均出現(xiàn)型別轉(zhuǎn)換現(xiàn)象,系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析顯示當(dāng)?shù)夭⑽闯霈F(xiàn)新的變異株,提示人群免疫水平變化等因素可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象發(fā)生的主要原因。5.本次研究發(fā)現(xiàn),基因重組在RVA、NoV和HAstV基因序列中均有檢出,提示多個傳播鏈和基因型共循環(huán)而產(chǎn)生的混合感染現(xiàn)象在監(jiān)測地區(qū)較為普遍。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R181.3
【部分圖文】：

２４．６％邋（９９／４０３）、１６．６％邋（６７／４０３）和邋１１．２％邋（４５／４０３）。隨著監(jiān)測時間的持續(xù)，逡逑自２０１４年末開始，ＧＩ．６檢出比例呈逐漸增加趨勢，而ＧＩ．２、ＧＩ．３和ＧＩ．５呈下降逡逑趨勢，見圖４（八）。２０１５年后獲取的0１．６序列數(shù)占0１．６總序列數(shù)的９２．３％（１３１／１４２）。逡逑臨沂市共獲得邋４１２邋條序列，分屬邋ＧＩ．ｌ、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．４、ＧＩ．５、ＧＩ．６、ＧＩ．８逡逑和邋ＧＩ．９邋共邋８邋個基因型。其中邋ＧＩ．６邋占邋４５．１％邋（１８６／４１２），ＧＩ．３、ＧＩ．５邋和邋ＧＩ．２邋分別逡逑占邋１５．５％邋（６４／４１２）、１３．１％邋（５４／４１２）和邋１２．１％邋（５０／４１２）。在邋２０１４邋年后，ＧＩ．６逡逑？邐替代之前的ＧＩ．２、ＧＩ．３和ＧＩ．５，成為檢出比例最高的基因型，見圖４邋（Ｂ）？邋２０１４逡逑年后所獲ＧＩ．６序列數(shù)占ＧＩ．６總序列數(shù)比例高達(dá)９９．０％邋（１８４／１８６）。逡逑煙臺市共獲得邋３２３邋條序列，分屬邋ＧＩ．ｌ、ＧＩ．２、ＧＩ．３、ＧＩ．４、ＧＩ．５、ＧＩ．６邋和邋ＧＩ．９逡逑共７個基因型。其中0１．６占５３．９％（１７４／３２３），0１．５、0１．２和0１．３分別占１５．２°／０逡逑（４９／３２３）、１０．２％邋（３３／３２３）和邋９．９％邋（３２／３２３）。同樣，自邋２０１４邋年末起，ＧＩ．６邋替逡逑代之前的ＧＩ．２、ＧＩ．３和ＧＩ．５

４．１邐ＲＶＡ逡逑經(jīng)同源性比較和遺傳距離曲線分析，共發(fā)現(xiàn)４條ＲＶＡ重組序列（遺傳距離逡逑曲線見圖１６），呈現(xiàn)３種重組形式，分別為Ｇ９型內(nèi)重組、Ｐ［８］型內(nèi)重組和Ｐ［４］／Ｐ［８］逡逑序列間重組。重組序列具體特征見表１４，其中臨沂市未檢出重組序列。逡逑ＯＣＯＯＯＯ邋■邐邐邋邐邋ｒｒ３Ｕ－？ＦＷａｉ１３ｌｃａｎｎＭａ？ａｎ＜邐０邋０００００邋．邐＞ｃ？ｒ＞Ｍ逡逑－ＶＴ３？５－２ｆ？Ｗ？１３邐１邐＊Ｏ４６－；／（？？０１３逡逑邐邋（邋ｉ邐（邐Ｉ邋－邋ｌＹ３ａ８－ｌｔｔＫｌｆｔ７０ｌ３邐逡逑。１！９？邋？邐０３６＾３０邋■邐］逡逑＼邐＼邐／邐Ｉ邋ｖ邋１／．邋？逡逑岕邋＾邐邐邐邐邐邋Ｖ邋．邐曬、邐■邐，邐，邐ｕ逡逑’Ｓ？邐Ｍ２邐４８Ｓ邐＊４邐，邐ｎ＼邐ｋＡＩ邐ｆ？Ｊ邐ＨＭ逡逑ｏｏｏｏｏｏ邋■邐＜，Ｔ２ａｅ－ｚ＾４Ｖ３0ｉ？逡逑ＶＴ３７Ｊ－ｔ／？１？Ｊｒｊ0ｔ４邐ＯＯＯＯＯＯ邋？邐ｉｃｗＭｉｇａｒａ＇逡逑＼邐／邐）邐Ｉ－邋ｊＮＢｉｇ－Ｍｗａｎ邐逡逑Ｉ邐Ｉ邐０，，ａｓ逡逑１邐／ｉ邐／邐Ｉ邋卿■邐＼，＼邐／邐．逡逑、／邐、八ｖ、“邐＿邋＿邐、／Ａｖ逡逑邐

逑（共４條）。ＮｏＶＧＩＩ重組序列有３條，且只有ＧＩＩ．３／ＧＩＩ．６邋—種重組形式。逡逑濟(jì)南市ＮｏＶ序列中共發(fā)現(xiàn)６條重組序列（遺傳距離曲線見圖１７），且均來逡逑自于２０１３年。其中３條為ＮｏＶＧＩ重組序列，重組類型為ＧＩ．２／ＧＩ．３、ＧＩ．２／ＧＩ．４逡逑和ＧＩ．２／ＧＩ．５，其余３條為ＮｏＶＧＩＩ重組序列，且重組形式全為ＧＩＩ．３／ＧＩＩ．６。重組逡逑序列具體特征見表１５。逡逑０？０００．—邐：邋＼邐ＪｆＢ９－１／Ｇｌ？？１３ｓｃ？ｎｒ＜？＞．ｅ？ｉｒｅＢ邐０邋０００００邋－邐一邐邐邋，＿，邋ＭＳ－７／Ｑ�。�？）１３ｓｃ＊ｎｒ＜Ｍ邋ｉｓ＜Ｒ＞１逡逑ＪＮＳＳ－１０ＩＣ１２Ｗ１Ｓ邐＞０６？０！怎２０１３逡逑－－邋ＪＮ８７－７？１３ＩＺ０１３逡逑０９２０００邐＇邐！邐夬＇邐ｙ逡逑Ｉ邋}0．…ｒ邐１ｊ，ｓｍ0－邐、－＇邐／逡逑娜．＼邐＼」邐聊．＼邐ｙ逡逑３Ｓ９０２0（＾邐（邐，邐，邐＾邐＊２６７９0（＾邐１邐１邐

本文編號：2816180