研究背景:環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental Endocrine Disruptors,EEDs)是一類常見的環(huán)境有害物質(zhì),其干擾內(nèi)源性激素的合成、分泌、釋放、運(yùn)輸、結(jié)合、效應(yīng)及清除等各個(gè)環(huán)節(jié),具有模擬或拮抗內(nèi)源性激素的作用,從而導(dǎo)致生殖功能下降、結(jié)構(gòu)畸形和腫瘤等的發(fā)生。其中鄰苯二甲酸酯(Phthalates,PAEs)作為常用增塑劑,已成為全球最普遍的環(huán)境污染物之一,人群不可避免地處于低劑量鄰苯二甲酸酯混合物(Phthalates Mixtures,MIXPs)的長(zhǎng)期暴露中。因此,及早發(fā)現(xiàn)PAEs致生殖毒性的潛在風(fēng)險(xiǎn),尋找保護(hù)因子并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其對(duì)生殖系統(tǒng)的干預(yù)效果,具有重要的公共衛(wèi)生意義。本課題組前期研究根據(jù)我國(guó)人群PAEs的實(shí)際暴露水平,經(jīng)人-大鼠之間的種屬系數(shù)換算后設(shè)定為暴露劑量,發(fā)現(xiàn)MIXPs長(zhǎng)期低劑量暴露能夠?qū)е滦坌源笫笊扯拘?主要體現(xiàn)在性激素水平變化、睪丸組織病理改變、睪酮合成蛋白的表達(dá)水平改變等。并采用非靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù),在大鼠尿液中篩選出了17種MIXPs的暴露標(biāo)志物,其中有5種暴露標(biāo)志物(雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮、二氫睪酮、雌酮)與雄激素代謝途徑相關(guān),與雄性生殖毒效應(yīng)密切相關(guān)。那么這5種暴露標(biāo)志物是否亦有可能作為間接的毒效應(yīng)指標(biāo),從而更為靈敏地表征PAEs暴露致大鼠雄性大鼠生殖毒性的早期效應(yīng)?另一方面,我們發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化鋅干預(yù)能夠抑制PAEs暴露導(dǎo)致的SD大鼠雄性大鼠生殖毒性,主要體現(xiàn)在鋅干預(yù)回調(diào)了大鼠體重、雄性生殖器官的絕對(duì)質(zhì)量和相對(duì)質(zhì)量以及血清睪酮、黃體生成素(Luteinizing Hormone,LH)、卵泡刺激素(Follicle-stimulating Hormone,FSH)水平,改善睪丸組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)、睪酮合成關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平回調(diào)等。那么,5種暴露標(biāo)志物若可作為間接毒效應(yīng)指標(biāo),是否亦可評(píng)價(jià)保護(hù)因子(如鋅)對(duì)雄性生殖系統(tǒng)毒性干預(yù)效果?在此基礎(chǔ)上,本文研究如下:目的:本文基于靶標(biāo)分析技術(shù)對(duì)非靶標(biāo)代謝組學(xué)篩選出的與雄性生殖系統(tǒng)功能緊密相關(guān)的5種暴露標(biāo)志物(雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮、二氫睪酮和雌酮)進(jìn)行定量分析,研究尿液中該5種暴露標(biāo)志物同時(shí)是否可作為間接毒效應(yīng)指標(biāo)以判斷雄性大鼠生殖毒性,另一方面,通過(guò)鋅對(duì)PAEs致雄性大鼠生殖毒性干預(yù)實(shí)驗(yàn),研究5種暴露標(biāo)志物的變化是否可作為評(píng)價(jià)PAEs致雄性大鼠生殖毒性干預(yù)效果的指標(biāo)。方法:(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法:實(shí)驗(yàn)選擇清潔級(jí)6周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,體重180-220 g。50只雄性SD大鼠隨機(jī)分成5組(n=10),即A:正常對(duì)照組(NC);B:鋅缺乏對(duì)照組(ZD);C:MIXPs暴露組(MIXPs);D:MIXPs暴露-鋅缺乏組(MIXPs-ZD);E:MIXPs暴露-鋅強(qiáng)化干預(yù)組(MIXPs-ZE)。其中,A組大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng),每天5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液等劑量灌胃;B組大鼠鋅缺乏飼料飼養(yǎng);C組大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng),同時(shí)經(jīng)口灌胃160 mg/kg/d MIXPs;D組大鼠鋅缺乏飼料飼養(yǎng),同時(shí)經(jīng)口灌胃160 mg/kg/d MIXPs;E組大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng),同時(shí)經(jīng)口灌胃160 mg/kg/d MIXPs和13 mg/kg/d ZnSO_4(補(bǔ)充5.25 mg/kg/d的鋅元素)。所有大鼠均連續(xù)灌胃90天,在染毒第0天及第30、60、90天分別收集大鼠24小時(shí)尿樣。(2)靶標(biāo)化合物分析方法的建立與評(píng)價(jià):LC-MS/MS方法用于尿液中雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮和二氫睪酮的檢測(cè)。色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18(100mm×2.1mm×1.7μm),柱溫30°C;流動(dòng)相A為水(0.1%甲酸),B為乙腈,采用非線性梯度洗脫,流速為0.4 mL/min,進(jìn)樣量為5μL。在電噴霧離子化(ESI)正離子掃描模式下首先確認(rèn)目標(biāo)物的母離子,后進(jìn)行子離子掃描確認(rèn)定性離子對(duì)和碰撞能量。HPLC-DAD方法用于尿液中雌酮的檢測(cè)。色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm×5μm),柱溫30°C;流動(dòng)相A為水(0.1%甲酸),B為乙腈,采用等梯度洗脫,程序?yàn)?A為30%,B為70%,流速為1.0 mL/min。進(jìn)樣量為20μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。結(jié)果:(1)5種靶標(biāo)化合物的檢出限分別為雄烯二酮(0.02 ng/mL)、睪酮(0.01 ng/mL)、脫氫表雄酮(0.15 ng/mL)、二氫睪酮(0.12 ng/mL)和雌酮(1 ng/mL)。線性范圍分別為雄烯二酮(0.06~100 ng/mL)、睪酮(0.03~100 ng/mL)、脫氫表雄酮(0.5~100 ng/mL)、二氫睪酮(0.4~100 ng/mL)和雌酮(3~100 ng/mL)。大鼠尿液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5種靶標(biāo)化合物的回收率為88.2%~110.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于15.8%(n=6),具有良好的方法準(zhǔn)確度和精密度。與文獻(xiàn)方法相比,雄烯二酮、睪酮和二氫睪酮檢測(cè)靈敏度更高。大鼠尿液中雌酮的檢測(cè)是基于本課題組自主研發(fā)的PA6納米纖維膜的固相萃取前處理方法,萃取介質(zhì)和有機(jī)溶劑消耗少,方法簡(jiǎn)便;方法回收率達(dá)到88.2%~110.0%,滿足實(shí)際樣品檢測(cè)要求。(2)尿液實(shí)際樣品檢測(cè):大鼠尿樣中靶標(biāo)化合物的水平為經(jīng)尿肌酐含量校正的檢測(cè)濃度。MIXPs暴露大鼠90天導(dǎo)致大鼠尿液中雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮和二氫睪酮濃度水平較對(duì)照組增高,且在第60天時(shí),這4種暴露標(biāo)志物濃度與對(duì)照組相比均顯著升高(P0.05)。然而,尿液中雌酮響應(yīng)值的變化與這4種暴露標(biāo)志物的變化趨勢(shì)相反,呈下降趨勢(shì),從第30天開始,大鼠尿液中雌酮水平與對(duì)照組相比均出現(xiàn)顯著下降(P0.05)。鋅缺乏飼料喂養(yǎng)大鼠90天導(dǎo)致大鼠尿液中5種暴露標(biāo)志物水平較對(duì)照組相比顯著降低(P0.05)。MIXPs-鋅缺乏暴露組大鼠尿液中5種暴露標(biāo)志物水平變化和時(shí)效變化趨勢(shì)同MIXPs暴露組。MIXPs-鋅強(qiáng)化暴露大鼠90天導(dǎo)致大鼠尿液中5種暴露標(biāo)志物水平較MIXPs暴露組均出現(xiàn)明顯回調(diào)(P0.05),趨于對(duì)照組水平。MIXPs-鋅強(qiáng)化暴露大鼠90天導(dǎo)致大鼠尿液中5種暴露標(biāo)志物水平較MIXPs-鋅缺乏暴露組也出現(xiàn)了明顯回調(diào)(P0.05),趨于對(duì)照組的水平。結(jié)論:(1)基于C_(18)固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和PA6納米纖維固相萃取-高效液相色譜法建立了靈敏、準(zhǔn)確的大鼠尿液中5種暴露標(biāo)志物(雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮、二氫睪酮和雌酮)的分析測(cè)定方法。(2)尿液中5種暴露標(biāo)志物可以作為判斷PAEs致雄性大鼠生殖毒性間接毒效應(yīng)指標(biāo)以及鋅干預(yù)PAEs致雄性大鼠生殖毒性早期治療判斷的指標(biāo),可望為PAEs暴露毒效應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)預(yù)警,實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù),對(duì)干預(yù)措施及其干預(yù)效果的評(píng)價(jià)等提供客觀依據(jù)。尿樣取樣方便,有利于實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)PAEs暴露導(dǎo)致的雄性大鼠生殖毒性,同時(shí)檢測(cè)5種靶標(biāo)化合物也有助于提高毒效應(yīng)監(jiān)測(cè)的可靠性。
【學(xué)位單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

圖 1.1 MIXPs 暴露致大鼠雄性大鼠生殖毒性機(jī)制示意圖運(yùn)用非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法篩選出了 MIXPs 暴露大鼠及對(duì)照組大鼠尿液中的 17 種差異化合物，自第 14 天起，尿液中這些化合物的濃度與對(duì)照組相比即發(fā)生了改變，至第 60 天顯著的改變，且具有劑量-效應(yīng)依賴性和時(shí)間-效應(yīng)依賴性。且這些化合物濃度與 MIXPs 暴露呈現(xiàn)時(shí)間及劑量的正相關(guān)，即 17 種差異化合物是 MIXPs 暴露的標(biāo)志物[73]，其中，與甾類激素代謝（雄激素代謝）通路相關(guān)的 5 種暴露標(biāo)志物，即脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone）、雄烯二酮（Androstenedione）、睪酮（Testosterone）、二氫睪酮（Dihydrotestosterone）、雌酮（Estrone）與雄性大鼠生殖毒性的關(guān)系最為密切，其中脫氫表雄酮和二氫睪酮濃度在 MIXPs 暴露第 14天就發(fā)生了變化，結(jié)合大鼠長(zhǎng)期低劑量經(jīng)口MIXPs暴露致雄性生殖系統(tǒng)毒性的機(jī)制研究結(jié)果，提示這 5 種暴露標(biāo)志物是潛在的 MIXPs 暴露致雄性大鼠生殖毒性的間接效應(yīng)指標(biāo)，或可表征早期毒性效應(yīng)或評(píng)價(jià)暴露風(fēng)險(xiǎn)。因此，本文建立大鼠尿液中 5 種暴露標(biāo)志物（雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮、二氫睪酮

圖 2.1：標(biāo)準(zhǔn)溶液中 4 種暴露標(biāo)志物和內(nèi)標(biāo)物的色譜圖（100 ng/mL）。（1：雄烯二酮；2：睪酮；3：脫氫表雄酮；4：二氫睪酮；5：甲基睪酮（I.S.））

圖 2.1：標(biāo)準(zhǔn)溶液中 4 種暴露標(biāo)志物和內(nèi)標(biāo)物的色譜圖（100 ng/mL）。（1：雄烯二酮；2：睪酮；3：脫氫表雄酮；4：二氫睪酮；5：甲基睪酮（I.S.））

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