研究背景:環(huán)境內分泌干擾物(Environmental Endocrine Disruptors,EEDs)是一類常見的環(huán)境有害物質,其干擾內源性激素的合成、分泌、釋放、運輸、結合、效應及清除等各個環(huán)節(jié),具有模擬或拮抗內源性激素的作用,從而導致生殖功能下降、結構畸形和腫瘤等的發(fā)生。其中鄰苯二甲酸酯(Phthalates,PAEs)作為常用增塑劑,已成為全球最普遍的環(huán)境污染物之一,人群不可避免地處于低劑量鄰苯二甲酸酯混合物(Phthalates Mixtures,MIXPs)的長期暴露中。因此,及早發(fā)現PAEs致生殖毒性的潛在風險,尋找保護因子并動態(tài)監(jiān)測其對生殖系統(tǒng)的干預效果,具有重要的公共衛(wèi)生意義。本課題組前期研究根據我國人群PAEs的實際暴露水平,經人-大鼠之間的種屬系數換算后設定為暴露劑量,發(fā)現MIXPs長期低劑量暴露能夠導致雄性大鼠生殖毒性,主要體現在性激素水平變化、睪丸組織病理改變、睪酮合成蛋白的表達水平改變等。并采用非靶標代謝組學技術,在大鼠尿液中篩選出了17種MIXPs的暴露標志物,其中有5種暴露標志物(雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮、二氫睪酮、雌酮)與雄激素代謝途徑相關,與雄性生殖毒效應密切相關。那么這5種暴露標志物是否亦有可能作為間接的毒效應指標,從而更為靈敏地表征PAEs暴露致大鼠雄性大鼠生殖毒性的早期效應?另一方面,我們發(fā)現強化鋅干預能夠抑制PAEs暴露導致的SD大鼠雄性大鼠生殖毒性,主要體現在鋅干預回調了大鼠體重、雄性生殖器官的絕對質量和相對質量以及血清睪酮、黃體生成素(Luteinizing Hormone,LH)、卵泡刺激素(Follicle-stimulating Hormone,FSH)水平,改善睪丸組織病理學結構、睪酮合成關鍵蛋白的表達水平回調等。那么,5種暴露標志物若可作為間接毒效應指標,是否亦可評價保護因子(如鋅)對雄性生殖系統(tǒng)毒性干預效果?在此基礎上,本文研究如下:目的:本文基于靶標分析技術對非靶標代謝組學篩選出的與雄性生殖系統(tǒng)功能緊密相關的5種暴露標志物(雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮、二氫睪酮和雌酮)進行定量分析,研究尿液中該5種暴露標志物同時是否可作為間接毒效應指標以判斷雄性大鼠生殖毒性,另一方面,通過鋅對PAEs致雄性大鼠生殖毒性干預實驗,研究5種暴露標志物的變化是否可作為評價PAEs致雄性大鼠生殖毒性干預效果的指標。方法:(1)動物實驗方法:實驗選擇清潔級6周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,體重180-220 g。50只雄性SD大鼠隨機分成5組(n=10),即A:正常對照組(NC);B:鋅缺乏對照組(ZD);C:MIXPs暴露組(MIXPs);D:MIXPs暴露-鋅缺乏組(MIXPs-ZD);E:MIXPs暴露-鋅強化干預組(MIXPs-ZE)。其中,A組大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng),每天5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液等劑量灌胃;B組大鼠鋅缺乏飼料飼養(yǎng);C組大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng),同時經口灌胃160 mg/kg/d MIXPs;D組大鼠鋅缺乏飼料飼養(yǎng),同時經口灌胃160 mg/kg/d MIXPs;E組大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng),同時經口灌胃160 mg/kg/d MIXPs和13 mg/kg/d ZnSO_4(補充5.25 mg/kg/d的鋅元素)。所有大鼠均連續(xù)灌胃90天,在染毒第0天及第30、60、90天分別收集大鼠24小時尿樣。(2)靶標化合物分析方法的建立與評價:LC-MS/MS方法用于尿液中雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮和二氫睪酮的檢測。色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18(100mm×2.1mm×1.7μm),柱溫30°C;流動相A為水(0.1%甲酸),B為乙腈,采用非線性梯度洗脫,流速為0.4 mL/min,進樣量為5μL。在電噴霧離子化(ESI)正離子掃描模式下首先確認目標物的母離子,后進行子離子掃描確認定性離子對和碰撞能量。HPLC-DAD方法用于尿液中雌酮的檢測。色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm×5μm),柱溫30°C;流動相A為水(0.1%甲酸),B為乙腈,采用等梯度洗脫,程序為:A為30%,B為70%,流速為1.0 mL/min。進樣量為20μL,檢測波長為230 nm。結果:(1)5種靶標化合物的檢出限分別為雄烯二酮(0.02 ng/mL)、睪酮(0.01 ng/mL)、脫氫表雄酮(0.15 ng/mL)、二氫睪酮(0.12 ng/mL)和雌酮(1 ng/mL)。線性范圍分別為雄烯二酮(0.06~100 ng/mL)、睪酮(0.03~100 ng/mL)、脫氫表雄酮(0.5~100 ng/mL)、二氫睪酮(0.4~100 ng/mL)和雌酮(3~100 ng/mL)。大鼠尿液進行加標回收率實驗結果表明5種靶標化合物的回收率為88.2%~110.0%,相對標準偏差(RSD)小于15.8%(n=6),具有良好的方法準確度和精密度。與文獻方法相比,雄烯二酮、睪酮和二氫睪酮檢測靈敏度更高。大鼠尿液中雌酮的檢測是基于本課題組自主研發(fā)的PA6納米纖維膜的固相萃取前處理方法,萃取介質和有機溶劑消耗少,方法簡便;方法回收率達到88.2%~110.0%,滿足實際樣品檢測要求。(2)尿液實際樣品檢測:大鼠尿樣中靶標化合物的水平為經尿肌酐含量校正的檢測濃度。MIXPs暴露大鼠90天導致大鼠尿液中雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮和二氫睪酮濃度水平較對照組增高,且在第60天時,這4種暴露標志物濃度與對照組相比均顯著升高(P0.05)。然而,尿液中雌酮響應值的變化與這4種暴露標志物的變化趨勢相反,呈下降趨勢,從第30天開始,大鼠尿液中雌酮水平與對照組相比均出現顯著下降(P0.05)。鋅缺乏飼料喂養(yǎng)大鼠90天導致大鼠尿液中5種暴露標志物水平較對照組相比顯著降低(P0.05)。MIXPs-鋅缺乏暴露組大鼠尿液中5種暴露標志物水平變化和時效變化趨勢同MIXPs暴露組。MIXPs-鋅強化暴露大鼠90天導致大鼠尿液中5種暴露標志物水平較MIXPs暴露組均出現明顯回調(P0.05),趨于對照組水平。MIXPs-鋅強化暴露大鼠90天導致大鼠尿液中5種暴露標志物水平較MIXPs-鋅缺乏暴露組也出現了明顯回調(P0.05),趨于對照組的水平。結論:(1)基于C_(18)固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法和PA6納米纖維固相萃取-高效液相色譜法建立了靈敏、準確的大鼠尿液中5種暴露標志物(雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮、二氫睪酮和雌酮)的分析測定方法。(2)尿液中5種暴露標志物可以作為判斷PAEs致雄性大鼠生殖毒性間接毒效應指標以及鋅干預PAEs致雄性大鼠生殖毒性早期治療判斷的指標,可望為PAEs暴露毒效應發(fā)生風險的預測預警,實現早發(fā)現、早干預,對干預措施及其干預效果的評價等提供客觀依據。尿樣取樣方便,有利于實現無創(chuàng)、動態(tài)地監(jiān)測PAEs暴露導致的雄性大鼠生殖毒性,同時檢測5種靶標化合物也有助于提高毒效應監(jiān)測的可靠性。
【學位單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

圖 1.1 MIXPs 暴露致大鼠雄性大鼠生殖毒性機制示意圖運用非靶標代謝組學方法篩選出了 MIXPs 暴露大鼠及對照組大鼠尿液中的 17 種差異化合物，自第 14 天起，尿液中這些化合物的濃度與對照組相比即發(fā)生了改變，至第 60 天顯著的改變，且具有劑量-效應依賴性和時間-效應依賴性。且這些化合物濃度與 MIXPs 暴露呈現時間及劑量的正相關，即 17 種差異化合物是 MIXPs 暴露的標志物[73]，其中，與甾類激素代謝（雄激素代謝）通路相關的 5 種暴露標志物，即脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone）、雄烯二酮（Androstenedione）、睪酮（Testosterone）、二氫睪酮（Dihydrotestosterone）、雌酮（Estrone）與雄性大鼠生殖毒性的關系最為密切，其中脫氫表雄酮和二氫睪酮濃度在 MIXPs 暴露第 14天就發(fā)生了變化，結合大鼠長期低劑量經口MIXPs暴露致雄性生殖系統(tǒng)毒性的機制研究結果，提示這 5 種暴露標志物是潛在的 MIXPs 暴露致雄性大鼠生殖毒性的間接效應指標，或可表征早期毒性效應或評價暴露風險。因此，本文建立大鼠尿液中 5 種暴露標志物（雄烯二酮、睪酮、脫氫表雄酮、二氫睪酮

圖 2.1：標準溶液中 4 種暴露標志物和內標物的色譜圖（100 ng/mL）。（1：雄烯二酮；2：睪酮；3：脫氫表雄酮；4：二氫睪酮；5：甲基睪酮（I.S.））

圖 2.1：標準溶液中 4 種暴露標志物和內標物的色譜圖（100 ng/mL）。（1：雄烯二酮；2：睪酮；3：脫氫表雄酮；4：二氫睪酮；5：甲基睪酮（I.S.））

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