目的:1,2-二氯乙烷(1,2-dichloroethane,1,2-DCE)常溫下是一種無色、無味、高揮發(fā)性的油狀液體,屬于高毒類。在工業(yè)生產(chǎn)中,1,2-DCE主要用于合成聚氯乙烯的單體。此外,作為有機溶劑也被廣泛應(yīng)用于粘合劑、脫脂劑和清洗劑等。作為有機溶劑,1,2-DCE極易揮發(fā),主要通過呼吸道進入人體,并被快速吸收入血。由于具有脂溶性,1,2-DCE易于通過BBB進入腦組織。盡管已有150多年的使用歷史,但在1990年以前,國內(nèi)外有關(guān)職業(yè)接觸1,2-DCE導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的人群和動物研究資料均極少~([1])。但自1990年以后,由于作為粘合劑廣泛應(yīng)用于玩具、塑料和制鞋等行業(yè),從廣東省開始,在我國的多個省市陸續(xù)發(fā)生亞急性1,2-DCE職業(yè)中毒事故,臨床表現(xiàn)以中毒性腦病和肝損傷為主。目前,亞急性1,2-DCE職業(yè)中毒已成為嚴重危害我國勞動者健康與生命的新職業(yè)病危害。然而,有關(guān)1,2-DCE亞急性毒性的資料仍很缺乏,亟待進行深入研究。研究資料顯示,細胞色素(Cytochrome)P450 2E1(CYP2E1)是介導體內(nèi)低分子化合物,特別是鹵代烴類化合物代謝的關(guān)鍵酶,且大多數(shù)鹵代烴類化合物在代謝過程中可促使CYP2E1表達上調(diào)。1,2-DCE經(jīng)CYP2E1代謝可生成化學性質(zhì)更活躍的中間產(chǎn)物氯乙醛和2-氯乙醇,最終被代謝為氯乙酸隨尿液排出體外。與其它CYP450亞型相比,CYP2E1具有更強的NADPH氧化酶活性,在催化底物代謝的過程中易出現(xiàn)電子傳遞的解偶聯(lián)現(xiàn)象,產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),進而引起細胞的氧化損傷。我們前期的研究結(jié)果表明1,2-DCE染毒可使小鼠肝和腦組織中CYP2E1的表達上調(diào),并引起小鼠肝和腦組織的氧化損傷。目前認為,CYP2E1是CYP450的一個亞型,主要分布在肝小葉中心區(qū)域,約占CYP450總量的7%。然而,大量研究數(shù)據(jù)顯示,在人和實驗動物的肝外組織中也有CYP2E1的表達分布。特別是腦組織的嗅球、海馬、小腦以及大腦額葉皮質(zhì)等區(qū)域的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中有相對較高水平CYP2E1表達。乙醇是公認的CYP2E1特異性誘導劑。有研究報道,急性和慢性乙醇暴露均可導致肝和腦組織中CYP2E1蛋白水平和酶活性升高。乙醇在CYP2E1催化下生成乙醛和乙酸。乙醛是乙醇體內(nèi)代謝的活性中間產(chǎn)物,可以與蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子反應(yīng)產(chǎn)生加合物,是導致組織細胞損傷的重要原因。有研究證實,乙醇引起的腦組織損傷區(qū)域與其誘導CYP2E1高表達區(qū)域密切相關(guān),這提示乙醇在腦組織的代謝是其產(chǎn)生神經(jīng)毒性的主要原因[20,21]。已有研究證明,乙醇通過上調(diào)CYP2E1的蛋白水平和酶活性促進氯仿和四氯化碳等鹵代烴化合物的代謝,并加重該類化學物引起的肝損傷�；谝陨涎芯砍晒臀覀兊难芯堪l(fā)現(xiàn),我們推測乙醇和1,2-DCE聯(lián)合暴露會加重肝和腦組織的損傷,導致酗酒工人對1,2-DCE毒性損傷的敏感性增強。綜上所述,本研究擬以昆明種小鼠為實驗對象,模擬飲酒工人職業(yè)暴露1,2-DCE的情況,在整體動物水平通過聯(lián)合給予乙醇與1,2-DCE,探討乙醇與1,2-DCE的聯(lián)合暴露在引起小鼠肝和腦組織的損傷方面是否存在交互作用,為揭示1,2-DCE對飲酒工人的健康影響,為1,2-DCE職業(yè)中毒的防治工作提供實驗參考數(shù)據(jù)。方法:1、實驗動物1.1分組1.1.1動物選擇:健康、性成熟、清潔級雌性昆明種小鼠60只,體重20-24克,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。建立不同濃度乙醇與1,2-DCE聯(lián)合暴露模型。實驗動物隨機分為6組,分別是空白對照組、乙醇對照組、1,2-DCE單純?nèi)径窘M及低、中和高劑量乙醇與1,2-DCE聯(lián)合暴露組,每組10只小鼠。1.1.2處理(1)染毒前處理模型中,1,2-DCE染毒前3d,乙醇對照組和聯(lián)合暴露組小鼠每天灌胃給予含乙醇3.0、0.75、1.5或3.0 g/Kg bw的水溶液0.2 ml,空白對照組和1,2-DCE單純?nèi)径窘M小鼠每天灌胃給予蒸餾水0.2 ml。(2)染毒模型中,各組小鼠灌胃后4 h,采用靜式吸入方式染毒,將小鼠置于100 L的染毒柜中3.5 h/d,連續(xù)染毒3d。單純?nèi)径窘M和聯(lián)合暴露組的染毒柜中1,2-DCE濃度為1.0 g/m~3,空白對照組和乙醇對照組的染毒柜中不加入1,2-DCE。于末次染毒結(jié)束后的次日處死小鼠,快速取出血、肝臟和腦組織,檢測如下指標。2、指標測定2.1腦臟器系數(shù)和腦含水量取腦組織,稱重。腦臟器系數(shù)=腦組織重量/小鼠體重。分離大腦半球,取左側(cè)大腦組織,用1/10000的分析天平稱其濕重,將其放入100℃恒溫烤箱中,烘烤48h至恒重后稱取干重。腦含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。2.2小鼠腦和肝組織病理學觀察取大腦和肝組織,經(jīng)4%多聚甲醛液固定72 h,常規(guī)石蠟包埋,腦組織連續(xù)冠狀切片,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察腦和肝組織病理變化。2.3血清中ALT和AST活性:采用生化試劑盒法。2.4肝和腦組織中GSH和MDA含量及SOD活性:采用生化試劑盒法。2.5腦組織中CYP2E1、ZO-1、Occludin、AQP4、Nrf2、HO-1、g-GCSc、GR和g-GCSm蛋白和m RNA含量:Western blot法和Real time RT-PCR法。2.6肝組織中CYP2E1、Nrf2、HO-1、g-GCSc、GR和g-GCSm蛋白和m RNA含量:Western blot法和Real time RT-PCR。3、統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較采用q檢驗(SNK)。以P0.05作為差異有統(tǒng)計學意義的判定標準。結(jié)果:1、中毒表現(xiàn)空白對照組、乙醇對照組和1,2-DCE單純?nèi)径窘M的小鼠未見明顯的中毒癥狀。而聯(lián)合暴露組的部分小鼠出現(xiàn)了肢體震顫和四肢不能完全伸展等癥狀,將小鼠尾巴輕輕提起,使小鼠頭朝下懸空時,小鼠的四肢不能完全伸展,出現(xiàn)雙前肢和/或雙后肢相互交叉的抱爪現(xiàn)象。低、中和高劑量聯(lián)合暴露組小鼠的腦損傷(抱爪和死亡)行為學改變率分別為20%(2/10)、50%(5/10)、50%(5/10),且只在高劑量聯(lián)合暴露組出現(xiàn)死亡(20%)。2、腦水腫相關(guān)指標的改變與對照組相比,中和高劑量聯(lián)合暴露組小鼠的腦臟器系數(shù)顯著升高(P0.05)。腦含水量隨著乙醇暴露劑量增加而增加,而與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);此外,中、高劑量聯(lián)合暴露組小鼠的腦組織呈現(xiàn)細胞間質(zhì)疏松,細胞核周圍腔隙增寬,胞漿淡染,胞體腫脹變性,邊緣模糊;部分細胞及毛細血管周圍腔隙擴張的腦水腫典型病理改變。3、肝損傷相關(guān)指標的改變低、中、高劑量聯(lián)合暴露組小鼠呈現(xiàn)肝損傷病理改變;與對照組相比,中、高劑量聯(lián)合暴露組小鼠血清中AST活性明顯升高(P0.05);與對照組、乙醇對照組相比,聯(lián)合暴露組ALT活性明顯升高(P0.05)。4、肝和腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標的改變4.1肝組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標的改變與對照組相比,聯(lián)合暴露組小鼠GSH含量顯著下降(P0.05);與對照組、乙醇對照組相比,聯(lián)合暴露組MDA含量明顯升高(P0.05);各組SOD活性變化無明顯差異(P0.05)。4.2腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標的改變與對照組、乙醇對照組、1,2-DCE單純?nèi)径窘M相、低劑量聯(lián)合暴露組相比,中、高劑量聯(lián)合暴露組MDA含量明顯升高(P0.05),乙醇與1,2-DEC對MDA指標水平具有協(xié)同作用;各組GSH含量、SOD活性變化無明顯差異(P0.05)。5、乙醇與1,2-二氯乙烷聯(lián)合暴露肝腦損傷發(fā)生機制5.1乙醇與1,2-DCE聯(lián)合暴露對小鼠血腦屏障相關(guān)蛋白及m RNA的影響聯(lián)合暴露組小鼠腦組織中Occludin、ZO-1蛋白出現(xiàn)不同程度含量下降,中、高劑量聯(lián)合暴露組下降趨勢更明顯,在m RNA水平也檢測到相同趨勢;乙醇與1,2-DEC對腦損傷Occludin、ZO-1蛋白表達水平具有協(xié)同作用,對腦組織Occludin、ZO-1m RNA表達水平具有協(xié)同作用。5.2乙醇與1,2-DCE聯(lián)合暴露對小鼠AQP4蛋白及m RNA的影響聯(lián)合暴露組小鼠腦組織中AQP4蛋白出現(xiàn)不同程度含量下降,中、高劑量聯(lián)合暴露組下降趨勢更明顯,在m RNA水平也檢測到相同趨勢。乙醇與1,2-DEC對腦組織AQP4m RNA表達水平具有協(xié)同作用。5.3乙醇與1,2-DCE聯(lián)合暴露對CYP2E1的影響聯(lián)合暴露組小鼠肝腦組織中CYP2E1蛋白出現(xiàn)不同程度的含量升高趨勢,中、高劑量聯(lián)合暴露組升高更顯著,在m RNA水平也檢測到上述相同趨勢;乙醇與1,2-DEC對肝組織CYP2E1m RNA指標具有協(xié)同作用,乙醇與1,2-DEC對腦組織CYP2E1蛋白、m RNA指標具有協(xié)同作用。5.4乙醇與1,2-DCE聯(lián)合暴露對小鼠NRF2信號通路相關(guān)蛋白及m RNA的影響聯(lián)合暴露組小鼠肝腦組織中Nrf2、HO-1、γ-GCSc、GR蛋白出現(xiàn)不同程度的含量升高趨勢,中、高劑量聯(lián)合暴露組升高更顯著,在m RNA水平也檢測到上述相同趨勢,而γ-GCSm在蛋白水平與基因水平均未檢測到顯著變化;乙醇與1,2-DEC對腦組織Nrf2蛋白指標具有協(xié)同作用,對肝組織Nrf2、γ-GCSc、GR蛋白指標具有協(xié)同作用,對肝、腦組織Nrf2、HO-1、γ-GCScm RNA指標具有協(xié)同作用。結(jié)論:1、乙醇與1,2-DCE聯(lián)合暴露能夠引起肝、腦聯(lián)合毒作用,且乙醇增強1,2-二氯乙烷誘導肝腦損傷,隨著乙醇暴露劑量增加,呈劑量效應(yīng)關(guān)系。2、乙醇與1,2-DCE聯(lián)合毒作用引起肝腦損傷,可能機制與乙醇增強1,2-二氯乙烷誘導表達CYP2E1,增加二氯乙烷代謝,產(chǎn)生大量活性氧自由基,產(chǎn)生氧化應(yīng)激,引起肝、腦氧化損傷有關(guān)。3、乙醇與1,2-DCE聯(lián)合毒作用引起肝、腦氧化應(yīng)激進一步激活Nrf2信號通路,使機體大量表達抗氧化蛋白酶HO-1、γ-GCSc、GR。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

20圖 3.2 各組小鼠肝微粒體中 CYP2E1 蛋白及 mRNA 相對含量比較（x± s，n=4）注：*P＜0.05，與對照組比較；＆P＜0.05，與乙醇對照組比較；#P＜0.05，與 1,2-DCE 單純?nèi)径窘M比較； P＜0.05，與低劑量聯(lián)合暴露組比較。A: 對照組；B: 乙醇對照組；C:1,2-DCE 單純?nèi)径窘M；D: 低劑量聯(lián)合暴露組；E: 中劑量聯(lián)合暴露組；F: 高劑量聯(lián)合暴露組。

圖 3.3 析因作用分析各組小鼠肝微粒體中 CYP2E1 蛋白及 mRNA 相對含量（x± s，n=4）注：A: 對照組；B: 乙醇對照組；C: 1,2-DCE 單純?nèi)径窘M； F: 高劑量聯(lián)合暴露組。3.6 乙醇與 1,2-DCE 聯(lián)合暴露對肝組織中 Nrf2 信號通路的影響3.6.1 肝臟組織中 NRF2 蛋白及 mRNA 相對含量圖 3.4 顯示，乙醇對照組、1,2-DCE 單純?nèi)径窘M NRF2 蛋白相對含量分別與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），而低、中、高劑量聯(lián)合暴露組 NRF2 蛋白相對含量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；低、中、高劑量聯(lián)合暴露組 NRF2 蛋白相對含量與乙醇對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；低、中、高劑量聯(lián)合暴露組 NRF2 蛋白相對含量與 1,2-DCE 單純?nèi)径窘M比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；中、高劑量聯(lián)合暴露組 NRF2 蛋白相對含量分別與低劑量聯(lián)合暴露組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。乙醇對照組、1,2-DCE 單純?nèi)径窘M NRF2 mRNA 相對含量分別與對照組比

23注：*P＜0.05，與對照組比較；＆P＜0.05，與乙醇對照組比較；#P＜0.05，與 1,2-DCE 單純?nèi)径窘M比較； P＜0.05，與低劑量聯(lián)合暴露組比較；$P＜0.05，與中劑量聯(lián)合暴露組比較。A:對照組；B: 乙醇對照組；C:1,2-DCE 單純?nèi)径窘M；D: 低劑量聯(lián)合暴露組；E: 中劑量聯(lián)合暴露組；F: 高劑量聯(lián)合暴露組。

【參考文獻】

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本文編號：2812003