作為環(huán)境污染物,砷(Arsenic,As)暴露可導(dǎo)致生殖異常、內(nèi)分泌紊亂、心血管疾病等慢性疾病,甚至是癌癥。糖尿病(diabetes mellitus,DM)作為慢性疾病的頭號殺手,早已受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。近年來有研究表明,飲水砷暴露可能增加糖尿病的發(fā)病風(fēng)險。我國面臨著大面積的環(huán)境砷暴露,燃煤砷暴露是其特色。燃煤砷暴露可污染水、食物、空氣,從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計,燃煤砷暴露和糖尿病的關(guān)聯(lián)性還未有研究報道證實。本研究開展了燃煤砷暴露地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查,通過性別和年齡配對的病例對照,檢測糖尿病人及非糖尿病人群尿砷水平并分析其與和糖尿病患病的關(guān)系;探討燃煤砷暴露和2型糖尿病是否存在關(guān)聯(lián)性。旨在為砷暴露與糖尿病發(fā)病的關(guān)系提供流行病學(xué)證據(jù)。糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的發(fā)生和發(fā)展過程中有重要作用。2型糖尿病患者的骨骼肌和外周組織中,GSK-3β蛋白活性明顯升高。GSK-3β通過糖原合成途徑參與調(diào)節(jié)糖代謝過程,同時又參與調(diào)控磷脂酞肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phishoinositide 3-kinase/Protein kinaseB,PI3K/AKT)通路和胰島素反應(yīng)。然而砷暴露糖尿病人中GSK-3β蛋白活性變化的研究鮮見報道。因此本研究通過檢測不同砷暴水平糖尿病人群及非糖尿病人群血清中GSK-3β表達(dá)水平及活性情況,并建立砷致糖代謝紊亂的大鼠模型,通過GSK-3β抑制劑干預(yù)后探討GSK-3β在砷致糖尿病發(fā)病中的可能作用。第一部分:砷暴露與2型糖尿病的病例對照研究目的:探討砷暴露與糖尿病的關(guān)聯(lián)性及不同砷暴露水平人群血清中GSK-3β表達(dá)水平。方法:本研究在貴州省安龍縣開展了燃煤砷暴露與糖尿病的1:1年齡和性別的病例對照研究。2型糖尿病病例組和正常對照組各232人。通過一對一問卷調(diào)查收集研究對象的人口學(xué)特征,經(jīng)專業(yè)護士人員采集空腹血和收集晨尿。全自動生化分析儀檢測血清中空腹血糖(Fsteing blood glucose,FBG)、總膽固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三脂(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、肌酐(Creatinine,CRE)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、白蛋白(Albumin,ALB)等生化指標(biāo)。原子熒光分光光度計檢測尿液和全血中砷含量,以尿砷含量定義砷暴露情況,我國尿砷安全指導(dǎo)限值為32μg/L,將尿砷水平大于32μg/L作為人群既往有砷暴露,低于32μg/L作為非砷暴露。ELISA檢測人群對照組(Control)、2型糖尿病組(T2DM)、砷暴露未患2型糖尿病組(As-Control)和砷暴露患2型糖尿病組(As-T2DM)樣本血清GSK-3β和磷酸化糖原合成酶激酶-3β(Phosphorylated glycogen synthase kinase-3β,P-GSK-3β),以P-GSK-3β/GSK-3β比值表示GSK-3β蛋白活性。采用logistic回歸,計算砷暴露和糖尿病之間的比值比(Odds Radio,OR)和95%置信區(qū)間(Confidence interval,CI),分析砷暴露和糖尿病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性。亞組分析探討砷暴露和糖尿病潛在的效應(yīng)修飾因素。結(jié)果:砷暴露和糖尿病的單因素logistic回歸結(jié)果中,砷暴露與糖尿病發(fā)病高風(fēng)險顯著相關(guān)(OR=2.09,95%CI:1.44~3.03)。經(jīng)多個模型調(diào)整了混雜因素,砷暴露與糖尿病發(fā)病高風(fēng)險仍顯著相關(guān)(OR=2.01,95%CI:1.4~3.0)。不同尿砷水平與糖尿病的關(guān)聯(lián)性不同,高尿砷水平患糖尿病的風(fēng)險更大(OR=2.68,95%CI:1.45~4.80)。進一步亞組分析發(fā)現(xiàn)在體質(zhì)指數(shù)(Body mass index,BMI)≥25kg/m~2,TG≥1.7mmol/L,ALT40U/L,CRE97μmol/L的人群中砷暴露與糖尿病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)強度更加明顯(P_(interaction)0.05)。ELISA結(jié)果顯示,T2DM-As組P-GSK-3β/GSK-3β比值的中位數(shù)為0.22,低于Control、T2DM、Control-As組,T2DM-As組GSK-3β蛋白活性高于Control、T2DM、Control-As組(P0.05)。結(jié)論:砷暴露可顯著增加糖尿病的發(fā)病風(fēng)險,這可能與砷進入體內(nèi)后GSK-3β活性增強有關(guān)。第二部分GSK-3β在砷致糖代謝紊亂中的作用目的:鑒于人群實驗發(fā)現(xiàn)砷暴露與GSK-3β蛋白活性存在相關(guān)性,及GSK-3β對糖尿病發(fā)生、發(fā)展有很重要的關(guān)系,所以本研究建立砷致糖代謝紊亂大鼠模型,探究GSK-3β在砷致糖尿病中的可能作用。方法:選擇健康清潔級SD雄性大鼠60只,體重200±20g,采用隨機數(shù)字表法將其分為6組,通過飲水砷染毒;Control組,5mg/kg As組、10mg/kg As組、15mg/kg Licl組、5mg/kg As+15mg/kg Licl組、10mg/kg As+15mg/kg Licl組,每組10只。每周檢測大鼠空腹血糖兩次;至第13周,空腹抽取眼眶血檢測大鼠糖化血紅蛋白和胰島素;與對照組比較,各染砷組鼠出現(xiàn)糖代謝指標(biāo)差異后,15mg/kg Licl組、5mg/kg As+15mg/kg Licl組、10mg/kg As+15mg/kg Licl組大鼠腹腔隔天注射GSK-3β抑制劑(15mg/kg Li Cl)。15周后處死大鼠,HE染色鏡下觀察大鼠肝臟組織病理學(xué)變化;原子熒光光度計檢測血、尿、各組織、毛發(fā)砷含量;ELISA檢測大鼠血清胰島素;計算各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)和胰島素敏感指數(shù);RT-q PCR檢測大鼠肝臟組織GSK-3βm RNA表達(dá)水平,Western Blot檢測大鼠肝臟GSK-3β、P-GSK-3β蛋白表達(dá)水平。以P-GSK-3β/GSK-3β比值表示GSK-3β蛋白活性。結(jié)果:1.大鼠砷暴露13周后,與Control組比較,各染砷組大鼠空腹血糖增加(P0.05),各染砷組大鼠空腹糖化血紅蛋白增加(P0.05),各染砷組大鼠空腹胰島素均降低(P0.05)。與Control組比較,各染砷組大鼠胰島素抵抗指數(shù)增加(P0.05),各染砷組大鼠胰島素敏感指數(shù)降低(P0.05)。2.大鼠砷暴露15周且15mg/kg Licl組、5mg/kg As+15mg/kg Licl組和10mg/kg As+15mg/kg Licl組腹腔注射GSK-3β抑制劑(Li Cl)兩周后,與Control組比較,5mg/kg As組、10mg/kg As組大鼠血糖仍增加(P0.05);5mg/kg As+15mg/kg Licl組、10mg/kg As+15mg/kg Licl組大鼠血糖與對照組無差異(P0.05)。5mg/kg As組、10mg/kg As組大鼠空腹胰島素低于Control組(P0.05),5mg/kg As+15mg/kg Licl組空腹胰島素高于5mg/kg As組(P0.05),10mg/kg As+15mg/kg Licl組空腹胰島素高于10mg/kg As組(P0.05)。3.與Control組比較,5mg/kg As組、10mg/kg As組大鼠胰島素抵抗指數(shù)增加和胰島素敏感指數(shù)降低(P0.05),5mg/kg As+15mg/kg Licl組胰島素抵抗指數(shù)組低于5mg/kg As組;5mg/kg As+15mg/kg Licl胰島素敏感指數(shù)組高于5mg/kg As組;10mg/kg As+15mg/kg Licl胰島素敏感指數(shù)組高于10mg/kg As組。4.與Control組比較,10mg/kg As、10mg/kg As+15mg/kg Licl組大鼠肝臟、脾臟、腎臟和胰腺的臟器系數(shù)增大(P0.05),5mg/kg As、5mg/kg As+15mg/kg Licl組大鼠腎臟的臟器系數(shù)增大(P0.05)。5.與Control組比較,10mg/kg As、10mg/kg As+15mg/kg Licl組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)異常,肝細(xì)胞索排列紊亂伴有水腫,匯管區(qū)可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。6.與Control組比較,5mg/kg As和10mg/kg As組大鼠肝臟GSK-3βmRNA表達(dá)水平增高(P0.05),5mg/kg As+15mg/kg Licl和10mg/kg As+15mg/kg Licl組大鼠肝臟GSK-3βm RNA表達(dá)水平無差異(P0.05);與10mg/kg As組比較,10mg/kg As+15mg/kg Licl組GSK-3βm RNA表達(dá)水平降低(P0.05)。7.各組大鼠GSK-3β蛋白水平無明顯變化。與Control組比較,5mg/kg As和10mg/kg As組大鼠肝臟Ser9-GSK-3β蛋白水平降低(P0.05),5mg/kg As+15mg/kg Licl和10mg/kg As+15mg/kg Licl組大鼠肝臟Ser9-GSK-3β蛋白水平無差異(P0.05);與5mg/kg As組比較,5mg/kg As+15mg/kg Licl組大鼠Ser9-GSK-3β蛋白水平增高(P0.05);與10mg/kg As組比較,10mg/kg As+15mg/kg Licl組大鼠Ser9-GSK-3β蛋白水平增高(P0.05)。8.與Control組比較,5mg/kg As和10mg/kg As組Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值降低,GSK-3β蛋白活性增高(P0.05),5mg/kg As+15mg/kg Licl和10mg/kg As+15mg/kg Licl組大鼠肝臟Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值無差異(P0.05)。與5mg/kg As組比較,5mg/kg As+15mg/kg Licl組Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值增高,GSK3β蛋白活性降低(P0.05)。與10mg/kg比較,10mg/kg As+15mg/kg Licl組Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值增高,GSK3β蛋白活性降低(P0.05)。結(jié)論:砷可能通過抑制GSK-3β的Ser9位點磷酸化,增強GSK-3β蛋白活性,進而發(fā)生胰島素抵抗和/或胰島素分泌減少,血糖升高,引起糖代謝紊亂。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.1;R114
【部分圖文】：

圖 1 研究人群尿砷和血砷水平Fig.1 The study population urinary arsenic and blood arsenic level.2 糖尿病預(yù)測因素的單因素 Logistic 回歸分析糖尿病預(yù)測因素單因素 Logistic 回歸分析結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，BMI、WHtR、TG、

圖 2 砷暴露與糖尿病發(fā)病風(fēng)險的亞組分析結(jié)果Fig.2 The results subgroup analyses on the association of arsenic exposure with the risk ofdiabets2.4 不同人群血清 GSK-3β 和 P-GSK-3β 表達(dá)情況檢測不同砷暴露水平人群血清 GSK-3β 和 P-GSK-3β 濃度發(fā)現(xiàn)，T2DM-As

圖 3 不同人群血清 GSK-3β、P-GSK-3β 和 P-GSK-3β/GSK-3β 差異Fig.3 Differences of serum GSK-3β, P-GSK-3β and P-GSK-3β/GSK-3β in differentpopulations3 討論

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本文編號：2811645