【摘要】：納米氧化鋅(ZnO NPs)被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、日用品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,對人類健康的潛在安全性問題備受關(guān)注。研究表明,ZnO NPs可通過呼吸道、消化道等途徑進入人體,還可經(jīng)血循環(huán)到達身體其他組織器官,引發(fā)相應(yīng)器官損傷。目前認為,ZnO NPs毒性效應(yīng)機制主要是由其誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的,氧化應(yīng)激可引發(fā)炎癥、DNA損傷及細胞凋亡等。氧化應(yīng)激也可引起靶細胞的應(yīng)激反應(yīng),包括基因表達改變。然而,目前ZnO NPs關(guān)鍵響應(yīng)基因認識并不全面。在本研究中,我們首先評價ZnO NPs對人肺泡上皮細胞A549的毒性效應(yīng)。表征鑒定結(jié)果顯示,我們實驗用的ZnO NPs平均粒徑為37.32nm,呈立體晶體狀,分散性較好且穩(wěn)定。利用CCK-8檢測ZnO NPs作用于A549細胞后的相對細胞活力,結(jié)果顯示,ZnO NPs對A549細胞顯著抑制濃度為7.5 μg/mL,并且隨著ZnO NPs濃度和時間的增加,細胞活力逐漸下降。此外,我們檢測ZnO NPs作用于細胞后總活性氧(ROS)生成情況,發(fā)現(xiàn)ROS含量隨ZnO NPs濃度增加呈現(xiàn)遞增趨勢,7.5 μg/mL引起ROS含量升高至對照組2倍。利用PI和Annexin V-FITC染色法檢測ZnO NPs處理后細胞凋亡情況。結(jié)果顯示,7.5 μg/mL的ZnO NPs引起Sub-G1期及Annexin V陽性細胞數(shù)顯著增加,說明ZnO NPs處理引起細胞凋亡。mRNA翻譯的調(diào)控在基因表達中發(fā)揮有重要作用,然而ZnO NPs對翻譯的影響目前尚沒有研究。于是,我們首先檢測了 ZnO NPs作用于A549細胞后核糖體的分布情況,結(jié)果顯示,ZnO NPs處理后多聚核糖體(翻譯效率高)比例顯著降低,而單核糖體(翻譯效率低)比例顯著增加,說明整體翻譯水平被抑制。此外,我們檢測ZnO NPs處理后翻譯調(diào)控蛋白4EBP1、eIF2α的磷酸化修飾水平,發(fā)現(xiàn)4EBP1的磷酸化水平逐漸降低,eIF2α的磷酸化水平逐漸升高,進一步說明ZnO NPs抑制細胞mRNA翻譯�；钚匝跚宄齽㎞AC預(yù)處理后,ZnO NPs對細胞翻譯的抑制效應(yīng)得以恢復(fù),說明ZnO NPs通過氧化應(yīng)激抑制細胞整體翻譯水平。隨后,我們利用核糖體展示技術(shù)(Ribo-seq)篩選ZnONPs處理后翻譯水平差異表達基因。以兩倍變化為標準篩選到翻譯水平差異表達基因2667個,其中2597個基因翻譯下調(diào),70個基因翻譯上調(diào)。GO功能性分析發(fā)現(xiàn)翻譯差異表達基因在生物學(xué)過程、細胞成分和分子功能中分別富集于細胞黏附、各種細胞膜成分和鈣離子結(jié)合等。KEGG通路分析則發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要富集于溶酶體、細胞外基質(zhì)-受體相互作用以及各種信號通路如Notch、PI3K-Akt、Wnt等。STRING數(shù)據(jù)庫聚簇分析發(fā)現(xiàn),翻譯表達上調(diào)基因主要集中在兩個功能豐富的簇集上,一個是轉(zhuǎn)錄因子簇(包括FOS、FOSB、JUNB、EGR1等),另一個是核糖體蛋白簇(包括RPL22、RPL10、RPS27A 等)。我們進一步對ZnO NPs處理后核糖體蛋白簇中變化最為顯著的RPL22進行驗證。結(jié)果顯示,ZnO NPs處理A549細胞后RPL22的蛋白水平上調(diào),而mRNA水平?jīng)]有明顯變化,提示ZnO NPs在翻譯水平促進RPL22表達。為明確核糖體蛋白RPL22在ZnO NPs誘導(dǎo)A549細胞凋亡中的作用,我們利用shRNA抑制內(nèi)源RPL22表達后,檢測細胞凋亡情況。結(jié)果表明,與對照組相比,敲降RPL22組Sub-G1期(凋亡細胞)細胞數(shù)顯著減少,說明RPL22介導(dǎo)ZnO NPs促進的細胞凋亡。綜上所述,本論文發(fā)現(xiàn):1)ZnO NPs引起A549細胞活力降低、ROS升高和細胞凋亡;2)ZnO NPs抑制A549細胞翻譯,降低蛋白質(zhì)合成速率;3)ZnONPs處理A549細胞1小時可影響約3,000個mRNA的翻譯,差異表達基因功能富集于細胞黏附、溶酶體等;4)ZnONPs影響包括RPL22在內(nèi)的多個核糖體蛋白的翻譯上調(diào);5)核糖體蛋白RPL22介導(dǎo)ZnO NPs誘導(dǎo)的細胞凋亡。本論文首次系統(tǒng)研究ZnO NPs短時間作用對細胞翻譯的影響,證明ZnO NPs引起的翻譯改變參與其毒性效應(yīng)。對差異基因功能的進一步深入研究將有助于闡明ZnO NPs毒性效應(yīng)機制。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R114
【圖文】：

一些研究認為ＺｎＯＮＰｓ釋放的Ｚｎ２＋在其毒性中起到重要作用。當ＺｎＯＮＰｓ逡逑濃度低于Ｚｎ２＋最大溶解濃度時，細胞毒性主要由Ｚｎ２＋導(dǎo)致，當ＮＰｓ濃度超過Ｚｎ２＋逡逑最大溶解濃度時，未溶解的ＮＰｓ起毒性作用［２０］。如圖１－１所示。逡逑Ｘ邋ＺｎＯ邋ＮＰ邋 ＂＊？邋Ｚｎ逡逑／邋ＶＬ逡逑［＼邋／逡逑Ｚｎ＞邐Ｖ—？邋［Ｚｎ２１１邐Ｉ逡逑Ｅｎｚｙｍｅｓ邋ｉ邐／逡逑ｎ．邐Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋NB邋Ｃａ２＊邋ｆｌｕｘ逡逑ｆａｃｔｏｒｓ邋ｌ邐ＲＯＳ邋ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ逡逑邐邋邐邐ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｄａｍａｇｅ逡逑ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ邋ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ逡逑圖１－１．邋ＺｎＯ邋ＮＰｓ引起的細胞毒性機制｜２１］逡逑１．２邋ＺｎＯ邋ＮＰｓ對基因表徶的影響逡逑ＮＰｓ產(chǎn)生ＲＯＳ的途徑主要通過自身結(jié)合０２產(chǎn)生0２＼活化或損傷線粒體、促逡逑進ＮＡＤＰＨ氧化酶表達［２２］等。正常情況下，細胞產(chǎn)生ＲＯＳ發(fā)揮包括調(diào)控細胞分逡逑裂、免疫應(yīng)答等特定生理功能；過多則會損傷細胞內(nèi)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、ＤＮＡ等，從逡逑２逡逑

ｓｅｑ是近來發(fā)展起來的另一種翻譯研究方法，能夠有效監(jiān)測翻譯效率。通過將核糖逡逑體保護的ＲＮＡ片段分離并測序，識別正在翻譯的轉(zhuǎn)錄本，以發(fā)現(xiàn)基因翻譯調(diào)控的逡逑重要信息［３２］。如圖１－２所示。逡逑Ｐｏｌｙｓｏｍｅ邋ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ邐Ｒｉｂｏｓｏｍｅ邐ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ逡逑Ｉ邋ｎｒ邋＼邐＂＜＃８＾邐P�？辶x希卞澹掊澹掊危掊義希遙危幔螅邋澹簦潁澹幔簦恚澹睿翦義襄危駑義希櫻澹洌椋恚澹睿簦幔簦椋錚鑠義希櫻澹歟澹悖簦椋錚鑠澹錚駑澹澹媯媯椋悖椋澹睿ィ輳螅椋邋澹螅澹歟澹悖簦椋錚鑠義希簦潁幔睿螅歟幔簦澹溴澹遙危鈴澹鰣危咤澹遙校疲簀澹媯潁錚礤澹幔歟戾義希模危鈴澹恚椋悖潁錚幔潁潁幔澹危藉澹遙危鈴義希遙危粒螅澹皴危掊義希遙危粒螅澹皴義賢跡保玻芯糠胄實牧街趾頌翹宸治黽際酰郟常柏義媳疚囊勻朔紊掀は赴粒擔矗瓜赴赴Ｐ�，系统研究ＺｎＯ邋ＮＰｓ引汽R姆脲義細謀浼耙庖濉Ｊ紫燃觳猓冢睿襄澹危校蠖哉宸胄實撓跋歟凰婧笤擻茫遙椋猓錚螅澹竇ㄥ義希村義

本文編號：2803270