發(fā)布時間：2020-08-21 08:20

【摘要】：目的過氧化氫(Hydrogen Peroxide,H2O2)是目前常用染發(fā)劑的主要成分之一,可損傷毛發(fā)。人毛囊毛乳頭部位含有豐富的毛囊間充質干細胞(Hair Follicle Mesenchymal Stem Cells,HF-MSCs),HF-MSCs參與毛囊發(fā)生、毛囊周期循環(huán)和毛囊再生等重要過程。NANOG(The Transcription Factor of Embryonic Stem Cells,胚胎干細胞轉錄因子)是一種維持干細胞自我更新和多潛能分化的核心轉錄因子,在促進間充質干細胞增殖、維持未分化狀態(tài)中發(fā)揮重要作用,但作用機制尚不十分清楚。本研究旨在通過探討NANOG對HF-MSCs細胞生物學行為的影響并明確作用機制,利用H2O2建立HF-MSCs損傷模型,從而探討NANOG對H2O2誘導HF-MSCs損傷的保護作用及機制,為毛囊再生及毛囊損傷修復的研究提供理論依據。方法1.第一部分實驗中,首先通過拔取毛發(fā)結合組織塊培養(yǎng)法從人毛囊組織中分離獲取HF-MSCs。通過免疫熒光染色和流式細胞術鑒定間充質干細胞表面標志,茜素紅S和油紅O染色鑒定成骨、成脂分化潛能。利用慢病毒包裝方法將攜帶NANOG編碼序列的載體轉導HF-MSCs。通過繪制生長曲線、流式細胞術檢測細胞周期、衰老β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老、Western Blot檢測PARP1、AKT、p-AKT、ERK和p-ERK蛋白表達,探討NANOG對HF-MSCs細胞生物學行為的影響。通過Western Blot檢測蛋白表達并結合雙螢光素酶報告基因檢測,探討NANOG和PBX1的調控關系。此外,通過RNA干擾技術敲減PBX1和AKT以及加入PI3K/AKT抑制劑LY294002,探討NANOG、PBX1和AKT三者之間的關系。2.第二部分給予HF-MSCs一定劑量H2O2后,CCK-8法檢測細胞存活率、鏡下觀察細胞形態(tài)學改變、熒光探針檢測細胞內ROS水平及Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡率。Western Blot法檢測AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、PARP1和Caspase-3蛋白表達。3.第三部分通過檢測H2O2處理后細胞存活率、細胞內ROS水平、細胞凋亡率,探討NANOG是否具有保護作用,Western Blot檢測AKT、p-AKT、PARP1蛋白,利用PI3K/AKT抑制劑LY294002和RNA干涉敲減PARP1(116 k Da)后,檢測細胞存活率、細胞內ROS水平明確NANOG減輕H2O2對HF-MSCs損傷的機制。結果1.異位表達NANOG對HF-MSCs細胞生物學影響(1)分離獲取HF-MSCs,其表達間充質干細胞表面標志CD105、CD90、CD73、CD44,并具有成骨、成脂分化潛能。(2)細胞生長曲線第6天和第8天結果發(fā)現(xiàn),異位表達NANOG和過表達PBX1細胞數明顯多于對照組(Vector組);細胞周期結果發(fā)現(xiàn),異位表達NANOG和過表達PBX1減少G0/G1期阻滯,增加S期;NANOG組和PBX1組增殖指數高于對照組。(3)NANOG組和PBX1組鈣鹽結節(jié)形成比例均多于對照組;NANOG組和PBX1組脂滴形成均少于對照組。(4)第6代和第14代NANOG組和PBX1組衰老細胞陽性率明顯低于對照組。(5)Western Blot結果發(fā)現(xiàn),和對照組比較,NANOG組和PBX1組PARP1(116 k Da)表達上調、p-AKT表達增加且p16、p53、p21表達下降。(6)NANOG異位表達的PBX1蛋白表達明顯高于對照組;通過雙螢光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn),NANOG組螢光素酶活性明顯高于對照組。(7)NANOG異位表達后敲減PBX1顯著下調p-AKT表達并增加衰老細胞陽性率。(8)NANOG異位表達后加入PI3K/AKT抑制劑LY294002顯著下調p-AKT表達和PBX1表達并增加衰老細胞陽性率。(9)NANOG異位表達后敲減AKT顯著下調PBX1、p-AKT和AKT表達并增加衰老細胞陽性率。2.H2O2對HF-MSCs的損傷作用及機制(1)通過CCK-8法檢測不同濃度(0μM、100μM、200μM、400μM、800μM)H2O2處理2 h和400μM H2O2處理不同時間(0 h、1 h、2 h、4 h、6 h)細胞存活率,隨著H2O2處理濃度升高和H2O2作用時間延長,細胞存活率下降明顯。(2)不同濃度H2O2處理2 h,隨著濃度升高,鏡下觀察細胞逐漸失去正常形態(tài),存活細胞數目減少;熒光探針檢測發(fā)現(xiàn)細胞內ROS水平逐漸升高;Annexin V-FITC/PI法檢測發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率明顯升高。(3)Western Blot結果顯示,隨著濃度增加,p-AKT表達先升高后下降,p-ERK表達逐漸下降,cleaved caspase-3表達明顯增多,PARP1(116 k Da)表達下降,PARP1(89 k Da)表達上調;隨著時間增加,p-AKT表達下降,p-ERK表達下降,cleaved caspase-3表達明顯增多,PARP1(116 k Da)表達下降,PARP 1(89 k Da)表達上調。3.NANOG對H2O2致HF-MSCs損傷的保護作用及機制(1)NANOG-H2O2組和PBX1-H2O2組細胞存活率明顯高于Vector-H2O2組,ROS水平明顯低于Vector-H2O2組。(2)Vector-H2O2組細胞凋亡率明顯高于對照組;NANOG-H2O2組和PBX1-H2O2組細胞凋亡率均低于Vector-H2O2組。(3)NANOG-H2O2組和PBX1-H2O2組p-AKT表達明顯高于Vector-H2O2組;加入PI3K/AKT抑制劑LY294002,NANOG-H2O2組和PBX1-H2O2組細胞存活率高于抑制劑LY294002組且ROS水平低于抑制劑LY294002組。(4)NANOG-H2O2組和PBX1-H2O2組PARP1(116 k Da)表達明顯高于Vector-H2O2組;Vector-H2O2組PARP1(89 k Da)表達明顯高于對照組。通過RNA干涉敲減PARP1(116 k Da),NANOG-H2O2組和PBX1-H2O2組細胞存活率高于敲減組且ROS水平低于敲減PARP1組。結論1.NANOG通過PBX1上調p-AKT促進人毛囊間充質干細胞增殖并延緩衰老,且PBX1和AKT之間存在雙向調控。2.H2O2作用降低p-AKT和p-ERK表達,增加cleaved caspase-3和PARP1(89 kDa)表達,引起人毛囊間充質干細胞損傷。3.NANOG通過PBX1上調p-AKT和PARP1(116 k Da)減輕H2O2引起的人毛囊間充質干細胞損傷。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R114
【圖文】：

圖 2.1.1.2 毛囊及毛乳頭可分化的細胞類型[14]（The Hair Follicle: An Underutilized Source of Cells and Materials for RegenerativeMedicine. ACS Biomater Sci Eng, 2018, 4(4): 1193-1207.）

吉林大學博士學位論文12圖2.3.1.1 人 ESCs 和小鼠外胚層干細胞 NANOG、OCT4、SOX2 調控示意圖[18]NANOG 在不同細胞中維持自我更新和多潛能性所涉及的信號通路不同。Cheng 等[67]研究表明 NANOG 可通過下調 Wnt 信號調控大鼠表皮間充質干細胞增殖和分化；Munst 等[59]認為 NANOG 可通過下調 p27KIP1表達促進人成纖維細胞增殖；Kim 等[68]認為 NANOG 介導的 ERK 信號通路對維持胚胎干細胞自我更新和 NANOG 蛋白表達穩(wěn)定性至關重要。此外，Juhee 等[19]認為 NANOG 能逆轉BM-MSCs 衰老，促進其增殖和提高成肌分化潛能；Panagiotis 等[21]研究表明，NANOG 通過激活 TGF-β 和 ROCK 通路引起 ACTIN 磷酸化、MRTF-A 核移位以及 SRF 依賴的成肌基因表達，逆轉衰老干細胞成肌分化潛能。上述研究表明，NANOG 在不同細胞中維持自我更新和多潛能性的調控通路不盡相同。2.3.2 NANOG 在衰老和重編程方面的作用眾所周知，干細胞治療需要體外連續(xù)培養(yǎng)大量擴增干細胞，可造成干細胞發(fā)生復制性衰老進而自我更新和多潛能分化能力下降，嚴重限制其臨床應用，因此有關延緩干細胞衰老的研究具有重要意義[69]。細胞衰老的標志包括細胞形態(tài)學改變、細胞周期阻滯、衰老 β-半乳糖苷酶活性增加和衰老相關蛋白（p16INK4a、p53和 p21CIP/WAF）表達上調等。Andreadis 團隊一系列研究表明，NANOG 異位表達可延緩 BM-MSCs 衰老并促進其成肌分化潛能[19-21, 64]。Munst 等[59]研究表明

圖 3.2.2 慢病毒包裝 NANOG、PBX1、Vector 質粒圖譜3.2.2.1 質粒提取及濃度測定（1）搖菌：50 mL 離心管中加入 10 mL 滅菌的 LB 培養(yǎng)基 12 mL、氨芐抗

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 嚴冰浩;張燕;方碩;王越;劉厚奇;;間充質干細胞來源的外泌體的制備方法及應用[J];解剖學雜志;2016年05期

2 鐘玉蘭;淦鑫;;間充質干細胞源外泌體在肺部疾病中的應用與作用[J];中國組織工程研究;2019年13期

3 劉超;張麗君;陶昊;杜心潔;王芮;李文菁;丁淑梅;王怡;姜磊;黃玉香;;基于細胞生物學方法比較5種不同組織來源間充質干細胞的特征[J];中國組織工程研究;2019年33期

4 徐鄭美;邵立宇;孫宏亮;王瑤;許美花;魯文賡;;間充質干細胞在動物臨床上的應用前景[J];動物醫(yī)學進展;2019年08期

5 阿諾得 卡普蘭;廖聯(lián)明;王萍;譚建明;;間充質干細胞更改名稱的時候到了[J];中華細胞與干細胞雜志(電子版);2017年05期

6 邱坤銀;廖雄宇;郭淑儀;祁皓寧;藍菁菁;方建培;黃科;黎陽;徐宏貴;周敦華;;間充質干細胞治療兒童難治性遲發(fā)性出血性膀胱炎療效和安全性的臨床研究[J];中國實驗血液學雜志;2018年03期

7 陳俊秋;黃梁滸;;間充質干細胞及其外泌體促血管再生的分子機制研究進展[J];中國實驗血液學雜志;2018年06期

8 賴秀藍;馬廉;;間充質干細胞的臨床應用及產業(yè)化前景[J];中國小兒血液與腫瘤雜志;2016年06期

9 申曉靖;劉海蓉;劉新燕;趙鵬;鄭建金;盧恕來;王超;;阿司匹林影響人牙髓間充質干細胞成骨分化的新型藥理研究[J];中國醫(yī)學前沿雜志(電子版);2017年01期

10 陶一昕;馬鋼;;皮膚間充質干細胞的研究進展[J];中國科學:生命科學;2017年04期

相關會議論文 前10條

1 白雪;霍波;;面積約束情況下形狀對間充質干細胞分化的影響[A];第十一屆全國生物力學學術會議暨第十三屆全國生物流變學學術會議會議論文摘要匯編[C];2015年

2 李坦;劉卓;徐運;;人臍帶間充質干細胞治療脊髓小腦共濟失調3型的研究[A];中華醫(yī)學會第十八次全國神經病學學術會議論文匯編（上）[C];2015年

3 陳可;王丁;韓之波;朱德林;韓忠朝;;人臍帶間充質干細胞體外發(fā)揮免疫活性的研究[A];第12屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2009年

4 金明順;張毅;賈秀芬;周燕華;閆妍;劉慧雯;;小鼠脂肪間充質干細胞的分離、培養(yǎng)以及多潛能分化的研究[A];中國解剖學會第十一屆全國組織學與胚胎學青年學術研討會論文匯編[C];2009年

5 張彥;李尚珠;;間充質干細胞在血管工程中的機制及應用[A];2009全國中西醫(yī)結合周圍血管疾病學術交流會論文集[C];2009年

6 石玉;戴\戎;;周期性拉應力對間充質干細胞分化影響的研究[A];第九屆全國生物力學學術會議論文匯編[C];2009年

7 黎嬌;朱爭艷;杜智;駱瑩;王鵬;高英堂;;人臍帶間充質干細胞分泌物對肝細胞增殖和凋亡的影響[A];天津市生物醫(yī)學工程學會第30次學術年會暨生物醫(yī)學工程前沿科學研討會論文集[C];2010年

8 余慧;黃紅云;陳琳;王洪美;;生物反應器培養(yǎng)間充質干細胞的研究現(xiàn)狀[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經外科醫(yī)師分會第六屆全國代表大會論文匯編[C];2011年

9 覃永亮;曾慧蘭;卜欠欠;鐘啟;韓新愛;;尼古丁誘導人臍帶間充質干細胞凋亡的機制研究[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

10 喬淑敏;陳廣華;王易;吳德沛;;人臍帶間充質干細胞超微結構觀察[A];中華醫(yī)學會第十七次全國兒科學術大會論文匯編（下冊）[C];2012年

相關重要報紙文章 前10條

1 見習記者 卜葉;科學家勾勒間充質干細胞臨床應用“路線圖”[N];中國科學報;2019年

2 本報記者 劉艷芳;牙髓間充質干細胞填補了干細胞研究的空白[N];廣東科技報;2017年

3 上海生科院 上海交大醫(yī)學院健康科學研究所 曹楷;間充質干細胞：干細胞中的孫悟空[N];上�？萍紙�;2014年

4 第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院輸血科 李忠俊 整理 吳劉佳;間充質干細胞研究又見新方法[N];健康報;2013年

5 劉道安;細胞產品國家工程研究中心啟用間充質干細胞庫[N];健康報;2007年

6 記者　陳建強;首家間充質干細胞庫在津建成[N];光明日報;2006年

7 南方日報記者 嚴慧芳;選擇干細胞儲存須謹慎[N];南方日報;2016年

8 記者 李素鋒;我市首例間充質干細胞移植手術取得成功[N];臨汾日報;2009年

9 馮國梧;全球首個臍帶間充質干細胞庫規(guī)模化運營[N];科技日報;2008年

10 劉瑩清;全球首個臍帶間充質干細胞庫泰達規(guī)模運營[N];北方經濟時報;2008年

相關博士學位論文 前10條

1 陳曉;IFN-β基因導入間充質干細胞對非小細胞肺癌遷移增殖的作用及機制研究[D];山東大學;2019年

2 孔繁軒;HGF基因修飾的牙髓間充質干細胞對雙側卵巢切除誘導的骨質疏松模型早期骨量減少的保護作用及機制研究[D];軍事科學院;2019年

3 陳曉梅;間充質干細胞來源的外泌體防治慢性移植物抗宿主病的實驗研究[D];南方醫(yī)科大學;2019年

4 韓愚弟;低氧微環(huán)境誘導下脂肪間充質干細胞外泌體促進人脂肪組織移植成活及再血管化的研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2018年

5 王逸駿;LncRNA H19介導miR-188調控LCoR表達對小鼠骨髓間充質干細胞分化作用的實驗研究[D];吉林大學;2019年

6 時佳宏;NANOG在過氧化氫誘導人毛囊間充質干細胞損傷的保護作用及機制研究[D];吉林大學;2019年

7 馬彩云;間充質干細胞誘導分化為肺泡Ⅱ型上皮細胞修復肺損傷研究[D];中國農業(yè)科學院;2018年

8 浦雯雯;人小涎腺間充質干細胞體外快速成肝誘導相關研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2018年

9 韓兵;脂肪來源間充質干細胞旁分泌因子抗病理性瘢痕成纖維細胞纖維化的作用及分子機制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2018年

10 亓立峰;臍帶間充質干細胞及細胞因子共移植治療腦損傷的分子機理研究[D];山東大學;2018年

相關碩士學位論文 前10條

1 薛婧;低劑量地西他濱增強間充質干細胞對2型糖尿病小鼠胰島修復效應的研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2018年

2 張志慧;順鉑對腫瘤間充質干細胞IL-6表達的影響及機制研究[D];山東大學;2019年

3 楊格;人臍帶間充質干細胞微泡對類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞組蛋白乙�；接绊懙难芯縖D];山西醫(yī)科大學;2019年

4 王玲玲;LOX和Fibulin-5在人子宮內膜間充質干細胞修復大鼠子宮韌帶損傷中表達的實驗研究[D];山西醫(yī)科大學;2019年

5 韓曉瑾;人子宮內膜間充質干細胞的分離、鑒定及生長因子對其向韌帶成纖維細胞分化作用研究[D];山西醫(yī)科大學;2019年

6 袁瑞利;人子宮內膜間充質干細胞在修復大鼠子宮韌帶損傷過程中彈性蛋白的表達[D];山西醫(yī)科大學;2019年

7 張國虎;NO誘導的富含miR-126的胎盤間充質干細胞外泌體治療大鼠膿毒癥[D];安徽醫(yī)科大學;2019年

8 何繼晨;不同來源間充質干細胞對骨關節(jié)炎的治療作用[D];安徽醫(yī)科大學;2019年

9 陳哲;SDF-1α通過調節(jié)間充質干細胞miRNA-133的表達促進ITP患者Breg分化[D];南方醫(yī)科大學;2019年

10 林瑤;間充質干細胞來源的外泌體改善骨髓間充質干細胞體外衰老的初步研究[D];深圳大學;2018年

本文編號：2799137