發(fā)布時(shí)間：2020-08-14 07:34

【摘要】：目的探討親環(huán)素A(CypA)在游離二氧化硅(SiO_2)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化中的作用及其作用機(jī)制,從而進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞泡沫化對(duì)矽肺纖維化的影響。方法第一階段實(shí)驗(yàn),使用100 ng/ml的豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人周圍血單核細(xì)胞(THP-1),誘導(dǎo)分化為THP-1源性的巨噬細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組:空白對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理,給與ox-LDL對(duì)照組的培養(yǎng)基含終質(zhì)量濃度50μg/ml的ox-LDL的培養(yǎng)基,給與50μg/ml SiO_2組的培養(yǎng)基含終質(zhì)量濃度50μg/ml的SiO_2和50μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)基,給與100μg/ml SiO_2組的培養(yǎng)基含終質(zhì)量濃度為100μg/ml的SiO_2和50μg/ml的ox-LDL,培養(yǎng)48 h后,通過(guò)MIC測(cè)試條法檢測(cè)細(xì)胞活力,通過(guò)油紅O染色法和膽固醇試劑盒法觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的情況,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)巨噬細(xì)胞上清液中CypA表達(dá)情況,以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中CypA表達(dá)的情況。第二階段實(shí)驗(yàn),用同樣的方法建立泡沫細(xì)胞模型,采用慢病毒轉(zhuǎn)染使CypA過(guò)表達(dá),設(shè)立組別為空白對(duì)照組(Control,不做任何處理),過(guò)表達(dá)組(OE,過(guò)表達(dá)病毒),陰性對(duì)照組(NC,100μg/ml SiO_2+50μg/mlox-LDL+對(duì)照病毒),過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組(OE+T,100μg/ml SiO_2+50μg/mlox-LDL+過(guò)表達(dá)病毒);采用基因沉默的方法使CypA低表達(dá),設(shè)立組別為對(duì)照組(Control,不做任何處理),SiCypA組(SiCypA),陰性對(duì)照組(NC,NC+100μg/ml SiO_2+50μg/mlox-LDL),SiCypA實(shí)驗(yàn)組(SiCypA+T,SiCypA+100μg/ml SiO_2+50μg/mlox-LDL),培養(yǎng)48h。采用第一階段的方法檢測(cè)CypA的表達(dá)變化以及泡沫化情況。在第三階段,基于親環(huán)蛋白A的過(guò)表達(dá),CD36途徑被阻斷,細(xì)胞隨機(jī)分為以下四個(gè)實(shí)驗(yàn)組:對(duì)照組(DMSO),SSO抑制劑組(5μM SSO),模型組(DMSO+SiO_2+ox-LDL)以及SSO實(shí)驗(yàn)組(SSO+SiO_2+ox-LDL),每個(gè)組培養(yǎng)48h。使用與第一階段相同的方法觀察細(xì)胞泡沫化情況。將第一、二、三階段的各組別細(xì)胞的上清培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞(HFL-1),蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中膠原蛋白1(COLⅠ)和a平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)水平。結(jié)果1 MTS結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,SiO_2質(zhì)量濃度為100μg/ml時(shí)細(xì)胞活力最強(qiáng)。2油紅O染色結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,100μg/ml SiO_2組細(xì)胞泡沫樣變化顯著。3與空白對(duì)照組比較,ox-LDL對(duì)照組、50μg/ml SiO_2組、100μg/ml SiO_2組細(xì)胞內(nèi)TC、FC表達(dá)水平均升高(P0.01),且CE比重增加(P0.01)。4CypA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平均降低(P0.01),上清液中CypA表達(dá)水平均升高(P0.01)。5 CypA過(guò)表達(dá)模型構(gòu)建成功后,與NC相比,細(xì)胞上清液中CypA表達(dá)明顯增多(P0.01),油紅O染色結(jié)果顯示,OE+T組細(xì)胞橘紅色色脂滴明顯增多;與NC組相比,OE+T組細(xì)胞內(nèi)TC、FC表達(dá)水平均升高(P0.01),且CE比重增加(P0.05)。6巨噬細(xì)胞中CypA基因沉默后,與NC組相比,上清液中CypA表達(dá)降低(P0.01);SiCypA+T組橘紅色脂滴明顯減少,與NC組相比,SiCypA+T組細(xì)胞內(nèi)TC、FC表達(dá)水平均降低(P0.01),且CE比重減少(P0.05)。7親環(huán)蛋白A過(guò)表達(dá)模型中CD36蛋白的表達(dá)也增加(P0.01),SSO抑制劑阻斷CD36通路后,結(jié)果顯示,與DMSO+T組相比,SSO+T組細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴明顯減少,TC、FC表達(dá)水平均降低(P0.01),且CE比重減少(P0.05)。8用各組上清液刺激人肺成纖維細(xì)胞(HFL-1),結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,100μg/ml SiO_2組,COLⅠ和α-SMA蛋白水平均升高(P0.05);與NC組相比,OE+T組COLⅠ和α-SMA蛋白水平均升高(P0.05);與NC組相比,SiCypA+T組COLⅠ和α-SMA蛋白水平均降低(P0.05)。結(jié)論1 CypA在巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中的表達(dá)發(fā)生變化。2 CypA在巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中發(fā)揮一定作用。3 CypA發(fā)揮作用過(guò)程可能與介導(dǎo)CD36表達(dá)有關(guān)。4巨噬細(xì)胞泡沫化可介導(dǎo)矽肺纖維化過(guò)程。圖32幅;表12個(gè);參139篇。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R135.2
【圖文】：

空白對(duì)照組；B：ox-LDL 對(duì)照組；C：50 μg/ml SiO2組；D：100 μg/ml SiO2組；箭頭所示為脂質(zhì)顆粒環(huán)狀。圖 2 各組巨噬細(xì)胞油紅 O 染色情況（×400）Fig.2 macrophages oil red O staining of each group (×400)

A：空白對(duì)照組；B：ox-LDL 對(duì)照組；C：50 μg/ml SiO2組；D：100 μg/ml SiO2組圖 5 CypA 在巨噬細(xì)胞中表達(dá)的情況Fig.5 Expression of cyclophilin A in macrophages***

A：NC 組；B：OE+T 組；C：NC 組；D：OE+T 組圖 8 巨噬細(xì)胞中親環(huán)蛋白 A 的表達(dá)Fig.8 Expression of cyclophilin A in macrophages

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2792716