【摘要】：研究目的:由食源性致病菌引發(fā)的食品安全問(wèn)題屬于嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,而副溶血性弧菌是我國(guó)重點(diǎn)監(jiān)控的食源性致病菌之一。目前對(duì)副溶血性弧菌的檢測(cè)方法多存在操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)等問(wèn)題,且因食品樣品組分復(fù)雜,難以達(dá)到靈敏檢測(cè)要求。因此建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的副溶血性弧菌檢測(cè)方法,對(duì)預(yù)防和控制由副溶血性弧菌污染引發(fā)的食品安全問(wèn)題十分必要。本論文旨在構(gòu)建靈敏度高、準(zhǔn)確性好的副溶血性弧菌檢測(cè)方法,并對(duì)所建立的檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià),論文的研究工作可為食品中食源性致病菌的監(jiān)測(cè)提供一定的理論依據(jù)和檢測(cè)新方法,并為確保我國(guó)食品安全提供一定的技術(shù)支撐。研究方法:本論文建立了兩種新的副溶血性弧菌檢測(cè)方法。1.基于免疫磁分離技術(shù)可視化檢測(cè)副溶血性弧菌。該方法通過(guò)免疫磁分離技術(shù)富集分離副溶血性弧菌,利用二氧化錳納米探針特異性結(jié)合副溶血性弧菌,形成免疫磁珠-副溶血性弧菌-二氧化錳納米探針復(fù)合物。再在外加磁場(chǎng)下分離,利用抗壞血酸對(duì)磁分離產(chǎn)物進(jìn)行消解。當(dāng)待檢樣品中含有副溶血性弧菌時(shí),二氧化錳納米探針會(huì)與磁富集得到的副溶血性弧菌特異性結(jié)合,經(jīng)抗壞血酸還原作用產(chǎn)生大量的錳離子,錳離子使金納米粒子聚集,金納米溶液呈藍(lán)色;反之,當(dāng)待檢樣品中無(wú)副溶血性弧菌時(shí),二氧化錳納米探針被洗去,金納米溶液呈分散狀態(tài)下的紅色。據(jù)此實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣品中副溶血性弧菌的快速可視化檢測(cè);2.基于分子印跡技術(shù)檢測(cè)副溶血性弧菌。該方法以副溶血性弧菌為模板,以聚二甲基硅氧烷聚合物,制備印跡聚合物薄膜,采用化學(xué)氣相沉積法在制備的印跡聚合物薄膜表面修飾含氟硅烷化物層。通過(guò)印跡聚合物薄膜與副溶血性弧菌的特異性結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對(duì)副溶血性弧菌的快速、高效富集分離。進(jìn)一步用煮沸法提取已捕獲的副溶血性弧菌DNA,進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣品中副溶血性弧菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。研究結(jié)果:1.基于免疫磁分離技術(shù)可視化檢測(cè)副溶血性弧菌。該方法在最佳檢測(cè)條件下,副溶血性弧菌濃度在10~10~6 CFU·mL~(-1)范圍內(nèi),金納米溶液在525 nm處的吸光度與副溶血性弧菌濃度對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系,線性方程為A_(norm)=-0.128 lg N+0.893(R~2=0.997),檢測(cè)限為10 CFU·mL~(-1),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.48%~9.65%(n=3),加標(biāo)回收率在95.78%~101.83%之間。研究結(jié)果表明該方法特異性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。應(yīng)用該方法檢測(cè)蛤蜊樣品,副溶血性弧菌的測(cè)定范圍為10~10~6 CFU·mL~(-1)。該方法在45 min內(nèi)可完成檢測(cè),裸眼即可判讀結(jié)果,能夠滿足對(duì)副溶血性弧菌的快速檢測(cè)要求;2.基于分子印跡技術(shù)檢測(cè)副溶血性弧菌。原子力顯微鏡表征結(jié)果顯示,獲得的印跡聚合物空腔在空間和結(jié)合位點(diǎn)上與副溶血性弧菌的尺寸和形態(tài)完全匹配。當(dāng)富集時(shí)間為2 h時(shí),印跡聚合物薄膜對(duì)副溶血性弧菌的富集可達(dá)3.7×10~7CFU·mL~(-1)。該方法對(duì)副溶血性弧菌的測(cè)定范圍為10~4~10~8 CFU·mL~(-1),檢測(cè)限為10~4CFU·mL~(-1),特異性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好,已用于蛤蜊樣品檢測(cè),副溶血性弧菌的測(cè)定范圍為10~4~10~8 CFU·mL~(-1),結(jié)果滿意。研究結(jié)論:1.基于免疫磁分離技術(shù)檢測(cè)副溶血性弧菌,結(jié)合了免疫磁珠的高效富集和金納米的靈敏信號(hào)放大,無(wú)需增菌過(guò)程。2.基于分子印跡技術(shù)檢測(cè)副溶血性弧菌,提出了一種新型的印跡聚合物薄膜,通過(guò)在聚二甲基硅氧烷表面修飾含氟硅烷化物層,提高了印跡聚合物薄膜對(duì)副溶血性弧菌的選擇性。3.成功建立了兩種副溶血性弧菌檢測(cè)方法,即基于免疫磁分離技術(shù)和基于分子印跡技術(shù)檢測(cè)副溶血性弧菌,并對(duì)檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià),兩種檢測(cè)方法特異性好、靈敏度高、成本低且操作簡(jiǎn)單、快速。4.兩種檢測(cè)方法相互補(bǔ)充,具有較寬的測(cè)定范圍,且分別適用于不同的檢測(cè)場(chǎng)景,便于在基層檢測(cè)工作中普及應(yīng)用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R155.5

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本文編號(hào)：2791940