【摘要】：花生過敏影響全世界約5%的兒童和1.4~2%的成人的健康,是人類健康的重大威脅之一,其中Ara h 1是花生主要過敏原之一。已有的研究顯示熱處理會(huì)改變花生的致敏性,實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明,水煮和油炸會(huì)導(dǎo)致花生致敏性降低,而烘烤處理可以使花生致敏性升高,推測(cè)烘烤時(shí)發(fā)生的糖基化反應(yīng)影響了花生過敏原的致敏性。故本文以花生Ara h 1蛋白為研究對(duì)象,原核表達(dá)重組Ara h 1蛋白,用干熱法模擬糖基化反應(yīng)獲取終末糖基化Ara h 1蛋白,并分析了干熱處理導(dǎo)致Ara h 1蛋白結(jié)構(gòu)的改變;進(jìn)一步以BALB/c小鼠和RBL細(xì)胞為致敏性評(píng)估模型綜合評(píng)估糖基化對(duì)花生Ara h 1致敏性的影響;并在此基礎(chǔ)上研究了糖基化修飾影響Ara h 1致敏性的機(jī)理,揭示了糖基化修飾對(duì)過敏原在過敏反應(yīng)的各個(gè)階段產(chǎn)生的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:1重組花生Ara h 1蛋白和糖基化Ara h 1蛋白的獲取提取花生總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴(kuò)增得到Ara h 1基因序列,將該序列克隆至pET-28a載體中,構(gòu)建Ara h 1-pET-28a表達(dá)載體,進(jìn)行驗(yàn)證和測(cè)序,將測(cè)序成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)表達(dá)宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá),將以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白溶解后透析復(fù)性,鎳柱純化獲取重組蛋白,經(jīng)質(zhì)譜鑒定為重組花生Ara h 1蛋白(R-Ara h 1)。用干熱處理模擬糖基化反應(yīng),隨處理時(shí)間增長蛋白中游離氨基含量減少、結(jié)合糖含量增多,有果糖胺和高熒光水平小分子產(chǎn)生,推測(cè)有糖基化反應(yīng)發(fā)生,質(zhì)譜檢測(cè)和ELISA結(jié)果表明,在100℃干熱處60min后有終末糖基化特征結(jié)構(gòu)產(chǎn)生,表明獲取了終末糖基化Ara h 1蛋白(AGE-Ara h 1)。2糖基化修飾對(duì)重組花生Ara h 1蛋白致敏性影響的研究用BALB/c小鼠和RBL細(xì)胞致敏性評(píng)估模型分別研究了糖基化修飾的重組花生Ara h 1蛋白的致敏性。用AGE-Ara h 1蛋白以皮下注射的方式免疫BALB/c小鼠,結(jié)果表明與對(duì)照R-Ara h 1相比,AGE-Ara h 1致敏的小鼠體重增長率較低,脾臟質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,空腸和肺出現(xiàn)了更嚴(yán)重的炎性浸潤和充血現(xiàn)象,腹腔灌洗液中的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞有更高程度的脫顆�，F(xiàn)象;此外小鼠血清中有更高含量Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)、特異性抗體(IgE、IgG)和組胺,小腸和肺中有更高水平的TSLP基因表達(dá),表明糖基化組小鼠體內(nèi)有更嚴(yán)重的Th2型過敏反應(yīng);RBL細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,AGE-Ara h 1致敏的小鼠血清有更高的使RBL脫顆粒能力。綜上所述,AGE-Ara h 1致敏性更高,即糖基化修飾上調(diào)了R-Ara h 1蛋白的致敏性。3糖基化反應(yīng)上調(diào)花生Ara h 1蛋白致敏性的機(jī)理研究本文通過模擬胃液消化實(shí)驗(yàn)、IgE結(jié)合力實(shí)驗(yàn)和樹突細(xì)胞、RBL細(xì)胞模型分析了糖基化反應(yīng)對(duì)重組Ara h 1蛋白在過敏反應(yīng)不同階段產(chǎn)生的影響,結(jié)果表明糖基化修飾使花生Ara h 1抗消化能力上升;樹突細(xì)胞對(duì)糖基化Ara h 1有更高的攝取能力,且糖基化Ara h 1可上調(diào)樹突細(xì)胞RAGE表達(dá)和IL-10釋放;最后雖然糖基化使Ara h 1與IgE的結(jié)合能力略有下降,但增加了使RBL細(xì)胞脫顆粒的能力,進(jìn)而引發(fā)更嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：上海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R155
【圖文】：

肥大細(xì)胞活化，介質(zhì)釋放和癥狀表現(xiàn)(圖1-1)[8]�；ㄉ粩z入后，花生過敏原可以穿過腸粘膜，進(jìn)入人體的內(nèi)環(huán)境。抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APCs)如巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞或 B 淋巴細(xì)胞通過內(nèi)吞作用或吞噬作用攝取這些過敏原。一旦這些過敏原被內(nèi)化，它們就會(huì)被降解成寡肽并與主要的組織相容性復(fù)合物 II 類(MHC II)結(jié)合，形成MHC II 類肽復(fù)合物。隨后復(fù)合物被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面，與 T 細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別，抗原信息被呈遞給 CD4+T 細(xì)胞，該階段稱為抗原呈遞。研究表明，MHC II 類肽復(fù)合物和 TCR 之間的親和力較低

g 離心 30 min，取上清 10 μL 于 C18，3μm，250mm×75mm。1.0 譜中選 10 個(gè)強(qiáng)度最高的離子進(jìn)行行檢索。被時(shí) R-Ara h 1 蛋白和 AGE-A0μL；一抗為稀釋 500 倍的 CEL 抗建提取取花生總 RNA，結(jié)果見圖 2-1，提取的 RNA 完整性較好，基本

圖 2-2 花生 Ara h 1 基因的克隆Figure 2-2 Clone of Ara h 1 gene構(gòu)建的 Arah1-pMD-19T 載體轉(zhuǎn)化入 DH5α 大腸桿菌中，可以看al 的 LB 平板上有白色菌落生長(圖 2-3)，挑取白斑進(jìn)行通用引1、4、5 號(hào)單菌落經(jīng) PCR 擴(kuò)增后在 2000bp 附近有明顯條帶，表因插入 pMD-19T 載體中。

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