發(fā)布時間：2020-08-07 13:40

【摘要】：第一部分砷暴露引發(fā)小鼠皮層神經(jīng)元鐵死亡的研究目的:探究砷暴露引發(fā)的小鼠皮層神經(jīng)元丟失是否與鐵死亡有關(guān)。方法:選32只7周齡的健康雄性C57BL/6J小鼠,隨機平均分為高劑量砷組(50 mg/L)、中劑量砷組(5 mg/L)、低劑量砷組(0.5 mg/L)以及對照組(蒸餾水)4組,每組8只,采用飲水暴露的方式染毒6個月。通過HE染色觀察神經(jīng)元形態(tài);免疫熒光的方法檢測神經(jīng)元標記物NeuN和MAP2在皮層中的表達;透射電鏡觀察皮層神經(jīng)元內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu);SOD、GSH試劑盒檢測皮層組織中SOD、GSH含量;MDA、ATP、鐵試劑盒檢測組織總體和線粒體中MDA、ATP、鐵含量;Western-blot和qPCR檢測鐵死亡相關(guān)基因(IREB2、SLC7A11、VDAC3、GPX4)的表達水平;Western blot檢測MAPK通路蛋白pJNK1/2和pERK1/2,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78和CHOP表達水平。結(jié)果:(1)慢性砷暴露后,HE染色、NeuN與MAP2熒光結(jié)果顯示小鼠皮層有神經(jīng)元丟失,NeuN和MAP2熒光在中劑量(5 mg/L)與高劑量組(50 mg/L)中減少十分明顯,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);(2)皮層線粒體超微結(jié)構(gòu)顯示,高劑量組(50 mg/L)中,線粒體嵴明顯減少或者消失,線粒體膜密度濃縮,出現(xiàn)嚴重的空泡樣損傷;(3)高劑量組小鼠皮層組織中SOD的活力與GSH的含量與對照組相比明顯減少(P0.05);高劑量組脂質(zhì)過氧化物MDA與ATP在皮層組織中總體含量以及線粒體中的含量與對照組相比明顯減少(P0.05);Fe~(2+)在皮層組織中總體含量以及線粒體中的含量在砷暴露組中的含量相比于對照組明顯增加(P0.05);(4)各劑量組中IREB2、SLC7A11、GPX4蛋白與mRNA表達量逐漸降低,而VDAC3蛋白與mRNA表達量逐漸增加;(5)砷暴露組皮層組織內(nèi)置網(wǎng)激活蛋白GRP78和CHOP表達量相較于對照組增加,MAPK通路激活蛋白pJNK1/2和pERK1/2表達水平也增加(P0.05)。結(jié)論:慢性砷暴露會引發(fā)小鼠大腦皮層神經(jīng)元的丟失,線粒體結(jié)構(gòu)與功能的破壞,脂質(zhì)過氧化物與Fe~(2+)的堆積,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、MAPK通路的激活以及鐵死亡相關(guān)基因表達的改變,表明慢性砷暴露可能引起小鼠皮層神經(jīng)元發(fā)生鐵死亡。第二部分砷暴露引發(fā)PC-12細胞鐵死亡的研究目的:探究砷是否會誘導(dǎo)PC-12細胞發(fā)生鐵死亡。方法:PC-12的細胞活性檢測用CCK-8法;MitoSOX~(TM)紅色熒光探針標記細胞中線粒體活性氧,并通過流式細胞術(shù)進行檢測。結(jié)果:(1)砷暴露后PC-12細胞活性明顯降低,鐵死亡抑制劑DFO能有效抑制砷對PC-12的細胞毒性;(2)砷暴露可顯著增加PC-12細胞中線粒體ROS,而DFO能有效抑制砷引起的細胞內(nèi)線粒體ROS升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:砷可引起PC-12細胞活性降低、線粒體活性氧增加,鐵死亡抑制劑能通過抑制線粒體ROS途徑抑制砷的細胞毒性,表明砷暴露可能誘導(dǎo)PC-12細胞發(fā)生鐵死亡。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R114
【圖文】：

圖 1-1 砷處理后小鼠皮層 H&E 染色結(jié)果（100×，400×）Fig.1 H&E staining of cerebral cortex after arsenite treatment (magnification, 100 and 400.2 砷暴露對皮層組織中 NeuN、MAP2 表達水平的影響用免疫熒光的方法標記各組小鼠皮層組織的神經(jīng)元中特異性神經(jīng)元標記euN，結(jié)果顯示隨著亞砷酸鈉染毒劑量的增加，NeuN 的表達量逐漸降低（-2A），中劑量與高劑量組小鼠最為明顯，與對照組小鼠相比差異有統(tǒng)計學(xué)意P<0.05）（圖 1-2B）�？紤]到 NeuN 標記可能是由于蛋白質(zhì)耗盡或者丟失其抗原性而造成，故選用一個神經(jīng)元標記物 MAP2。結(jié)果同樣，發(fā)現(xiàn)隨著亞砷酸鈉染毒劑量的增加，MA表達量也逐漸降低，對照組與砷處理組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（-2A 和 2B）。

結(jié)果顯示隨著亞砷酸鈉染毒劑量的增加，NeuN 的表達量逐漸降低（圖1-2A），中劑量與高劑量組小鼠最為明顯，與對照組小鼠相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖 1-2B）。考慮到 NeuN 標記可能是由于蛋白質(zhì)耗盡或者丟失其抗原性而造成，故選用另外一個神經(jīng)元標記物 MAP2。結(jié)果同樣，發(fā)現(xiàn)隨著亞砷酸鈉染毒劑量的增加，MAP2的表達量也逐漸降低，對照組與砷處理組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖1-2A 和 2B）。

圖 1-2 各組小鼠皮層中 NeuN、MAP2 的熒光強度（100×，400×）注：*P<0.05 ,***P<0.001 與對照組相比較Fig.1-2 Fluorescence intensity of NeuN and MAP2 in cortex of mice in eacgroup(magnification, 100 and 400)Note：* denoted P<0.05 and ***denoted P<0.001, compared with the contr暴露對小鼠皮層線粒體的超微結(jié)構(gòu)的影響 6 月后，采用透射電鏡觀察皮層組織中線粒體超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯線粒體嵴明顯減少或者消失，線粒體膜密度濃縮，出現(xiàn)嚴重的空1-3）。

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本文編號：2784072