【摘要】：研究背景及研究目的： 帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常見的神經(jīng)退行性疾病之一。其病因主要有遺傳因素和環(huán)境因素。其主要病理表現(xiàn)是黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元（Dopaminergic Neuron, DN）的變性死亡及神經(jīng)元胞漿中路易小體(Lewy’s body)的積聚，引起多巴胺（Dopaminergic，DA）分泌不足，紋狀體DA水平下降。在PD患者中散發(fā)性病例約占95%，他們對外界環(huán)境毒素存在易感因素。隨著納米科學(xué)和納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，納米材料被大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用，人們通過環(huán)境、生態(tài)、工作場所暴露于各種納米顆粒和納米材料的機會和程度也日益增加。由于納米顆粒具有小尺度效應(yīng)和表面效應(yīng)以及由其所造成的巨大比表面積，使其表面有可能產(chǎn)生較多的活性位點來參加不同的生化反應(yīng)，故具有強大的穿透組織細胞的能力、較強的氧化能力和催化能力。最近研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centralnervous system，CNS)是納米顆粒的潛在毒作用靶器官。納米顆粒能穿越血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對腦組織造成損傷。吸入暴露后，在鼻腔黏膜上吸附并沉積的納米顆�？山�(jīng)嗅神經(jīng)通路進入腦組織。雖然納米材料的環(huán)境健康效應(yīng)已得到高度關(guān)注，但納米材料的神經(jīng)毒性研究還處于起步階段，尤其是針對多巴胺能神經(jīng)元的毒性效應(yīng)及其機制尚未明了，特別是體內(nèi)和體外實驗相結(jié)合的系統(tǒng)性研究的資料和數(shù)據(jù)十分有限。 本研究即對不同類型納米材料的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性進行了比較，包括兩部分研究內(nèi)容。在第一部分研究中選擇了碳納米材料-單臂碳納米管(single-wallcarbon nanotubes，SWCNTs)、非金屬納米氧化物-納米二氧化硅（SiO2-NPs）和金屬納米氧化物-納米氧化鋅(ZnO-NPs)3種不同種類的納米材料，通過檢測非暴露式氣管滴注染毒后大鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)和氧化應(yīng)激水平，對其中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性進行了比較。在第二部分研究中，在整體動物水平上，研究了納米氧化鋁（Al2O3-NPs）、納米氧化銅（CuO-NPs）和納米氧化鋅(ZnO-NPs)3種典型納米金屬氧化物經(jīng)鼻腔滴注暴露后在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要功能腦區(qū)的分布以及對相應(yīng)腦區(qū)的損傷作用；在細胞水平上對3種納米金屬氧化物致多巴胺能神經(jīng)元模型（PC12細胞）的毒性效應(yīng)及其機制進行了初步探討，為進一步進行作用機制的研究及納米顆粒經(jīng)呼吸暴露后對機體的毒性效應(yīng)評價提供科學(xué)依據(jù)，為PD等神經(jīng)退行性病變的病因?qū)W研究提供實驗參考，為納米材料環(huán)境健康防護標(biāo)準(zhǔn)的制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料。 研究內(nèi)容： (1)研究3種不同種類納米材料對非暴露式氣管滴注染毒大鼠的神經(jīng)毒性效應(yīng)； (2)研究3種典型納米金屬氧化物經(jīng)鼻腔滴注在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要功能腦區(qū)的分布； (3)研究3種典型納米金屬氧化物經(jīng)鼻腔滴注對大鼠大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要功能腦區(qū)的毒性效應(yīng)； (4)研究3種典型納米金屬氧化物對多巴胺能神經(jīng)元PC12細胞的毒性效應(yīng)； (5) CuO-NPs致多巴胺能神經(jīng)元PC12細胞毒性作用潛在機制的初步探討。研究方法： (1)納米材料染毒懸液的制備及參數(shù)表征：SWCNTs、SiO2-NPs、Al2O3-NPs、CuO-NPs和ZnO-NPs，以生理鹽水為分散劑制備納米顆粒懸液，透射電鏡和掃描電鏡觀察納米顆粒的分散狀態(tài)，并對其粒徑、形狀和化學(xué)組成等基本顆粒參數(shù)進行表征。 (2)3種不同種類納米材料對大鼠神經(jīng)毒性研究：SPF級雄性Wistar大鼠非暴露式氣管滴注SWCNTs、SiO2-NPs、ZnO-NPs，分為生理鹽水對照組和3種納米材料的高（15mg/kg體重）、低（3mg/kg體重）劑量組，隔日染毒1次，共4周。采用生物化學(xué)法檢測大鼠腦組織氧化損傷指標(biāo)丙二醛（MDA)、還原型谷胱甘肽（GSH）的含量及超氧化物歧化酶(SOD）的活性。采用高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography, HPLG)檢測單胺類神經(jīng)遞質(zhì)：腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)及其代謝產(chǎn)物5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)含量及氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(GABA)含量。并將腦組織切片，蘇木精一伊紅(HE)染色后光鏡下進行組織形態(tài)學(xué)檢查。 (3)通過動物整體實驗研究3種納米金屬氧化物在大鼠主要腦區(qū)的分布：采用鼻腔滴注方式對SPF級雄性Wistar大鼠進行染毒，分為生理鹽水對照組和3種納米材料暴露組（20mg/kg體重，每組5只），每天滴注1次，共15天。利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）分別檢測大鼠嗅球、海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)、小腦組織中AL、Cu、Zn元素的含量；利用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察嗅球、海馬、紋狀體組織超微結(jié)構(gòu)的變化及納米顆粒在組織中的定位。 (4)通過動物整體實驗研究3種納米金屬氧化物對大鼠主要腦區(qū)的毒性效應(yīng)：采用鼻腔滴注方式對SPF級雄性Wistar大鼠進行染毒，分為生理鹽水對照組和3種納米材料暴露組（20mg/kg體重，每組5只），每天滴注1次，共15天和30天。染毒期間觀察大鼠體重變化；染毒結(jié)束利用生物化學(xué)法檢測大鼠嗅球、海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)、小腦組織勻漿液中MDA含量、GSH活性，反應(yīng)各腦區(qū)氧化應(yīng)激水平；通過雙抗夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測上述腦區(qū)組織勻漿中細胞因子白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，反應(yīng)各腦區(qū)免疫炎性水平。 (5)通過體外細胞實驗研究納米材料對多巴胺能神經(jīng)元PC12細胞的毒性效應(yīng)：以細胞培養(yǎng)液配制3種納米顆�；鞈乙海�2、4、6、8、10、12、14、16、18、20μg/mLZnO-NPs混懸液；5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg/mL CuO-NPs混懸液；3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL Al2O3-NPs混懸液。分別與PC12細胞共培養(yǎng)，通過細胞形態(tài)學(xué)觀察、CCK-8實驗和乳酸脫氫酶（LDH）滲漏分析評價納米材料對細胞活性和細胞膜完整性的影響；通過Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細胞術(shù)分析細胞凋亡。通過碘化丙啶（PI）單染結(jié)合流式細胞術(shù)分析Al2O3-NPs、CuO-NPs致PC12細胞周期的變化；通過比色法檢測CuO-NPs暴露后PC12細胞裂解液中MDA、一氧化氮（NO）含量、總超氧化物歧化酶（SOD）、GSH、總GSH活性，探討CuO-NPs是否通過氧化應(yīng)激機制引發(fā)PC12細胞毒損傷。 研究結(jié)果： 1納米顆粒的參數(shù)表征 5種納米材料粒徑均40nm，純度在99.7%以上， Al2O3-NPs和CuO-NPs為規(guī)則球形顆粒，SiO2-NPs、ZnO-NPs為六邊形晶體結(jié)構(gòu)，SWCNTs為束狀纖維，直徑約8nm，管長小于5μm，符合實驗要求。 2整體動物水平實驗研究 (1)3種不同種類納米材料對大鼠神經(jīng)毒性研究：非暴露式氣管滴注染毒4周后，SWCNTs低劑量組大鼠腦組織MDA含量顯著升高，高、低劑量組SOD活性均顯著降低；ZnO-NPs高、低劑量組MDA含量均顯著升高，高劑量組SOD活性顯著降低。ZnO-NPs高、低劑量組抑制性單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT和5-HIAA含量均顯著降低；SWCNTs高劑量組DA含量顯著降低。ZnO-NPs高劑量組興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu含量顯著升高；SWCNTs高劑量組Glu、Asp含量顯著升高；SiO2-NPs高、低劑量組Asp含量及低劑量組Glu含量顯著升高。ZnO-NPs高劑量組大鼠腦組織可見炎細胞浸潤。。 (2)3種納米金屬氧化物在大鼠腦組織中的分布：Al2O3-NPs、CuO-NPs和ZnO-NPs分別經(jīng)鼻腔滴注暴露15d后，ICP-MS檢測發(fā)現(xiàn)大鼠嗅球、海馬和紋狀體組織中Al、Cu元素含量顯著升高，大腦皮質(zhì)和小腦組織中Al、Cu元素含量有升高的趨勢，但沒有顯著性差異；各腦區(qū)中Zn元素含量有升高的趨勢，但沒有顯著性差異。同時TEM檢測發(fā)現(xiàn)3種納米從材料染毒組大鼠嗅球、海馬、紋狀體組織胞核和胞漿內(nèi)有納米顆粒沉積，并造成相應(yīng)腦區(qū)神經(jīng)纖維排列疏松、核膜缺損、染色質(zhì)凝集、線粒體損傷、胞漿內(nèi)形成空泡，甚至細胞壞死。 (3)3種納米金屬氧化物對大鼠腦組織的毒性作用：3種納米顆粒暴露均可造成大鼠體重顯著降低。3種納米材料暴露15d后，大鼠嗅球、海馬、紋狀體組織中GSH含量顯著降低，MDA的含量顯著升高；且ZnO-NPs亦可致大腦皮質(zhì)GSH含量顯著降低。3種納米材料暴露30d后，大鼠嗅球、海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)組織中GSH含量顯著降低，嗅球、海馬、紋狀體組織中MDA的含量顯著升高；且ZnO-NPs亦可造成小腦GSH含量顯著降低，大腦皮質(zhì)和小腦MDA含量顯著升高；CuO-NPs亦可造成大腦皮質(zhì)MDA的含量顯著升高。3種納米材料暴露15、30d后，大鼠嗅球、海馬、紋狀體組織IL-1β、TNF-α水平顯著升高，且ZnO-NPs亦可造成小腦組織TNF-α水平顯著升高；Al2O3-NPs暴露30d后亦可造成大腦皮質(zhì)、小腦組織中TNF-α水平顯著升高。 3體外細胞水平實驗研究 (1)形態(tài)學(xué)：對照組PC12細胞(分化型)形態(tài)正常，突起較長，細胞間突起連接點較多，胞質(zhì)透明度較大。染毒組出現(xiàn)不同程度的回縮變形，變圓漂浮、飽核固縮、胞內(nèi)形成許多空泡；細胞突起變短減少，甚至消失，細胞間突起連接點減少；胞質(zhì)內(nèi)顆粒物增多，透明度下降，細胞間隙和細胞表面有納米顆粒分布，對細胞的生長和代謝造成顯著影響，導(dǎo)致活細胞數(shù)明顯減少。ZnO-NPs和CuO-NPs暴露后對PC12細胞形態(tài)學(xué)的影響尤為嚴(yán)重。 (2)細胞毒性：3種納米顆�？娠@著降低PC12細胞活性，且呈現(xiàn)劑量依賴性和時間依賴性，在實驗暴露時間內(nèi)低劑量(10μg/mL)的ZnO-NPs對PC12細胞不產(chǎn)生毒性作用，而當(dāng)暴露劑量超過一定限值（12μg/mL）時即可造成PC12細胞大量死亡。3種納米顆粒可造成細胞培養(yǎng)液上清中LDH活性顯著升高，且CuO-NPs在低劑量(5μg/mL)時即已經(jīng)顯著高于對照組，而Al2O3-NPs和ZnO-NPs對胞外LDH釋放的作用較弱。 (3)細胞周期和細胞凋亡：3種納米顆�？梢l(fā)PC12細胞凋亡和壞死，低劑量、短時間暴露時細胞凋亡在細胞死亡進程中發(fā)揮主導(dǎo)作用，而隨著染毒時間的延長和染毒劑量的增加細胞壞死逐漸發(fā)揮主導(dǎo)作用。Al2O3-NPs暴露24h可導(dǎo)致PC12細胞周期阻滯在G0/G1期，同時伴隨著G2/M期細胞數(shù)量顯著降低；低劑量(10μg/mL)CuO-NPs暴露可導(dǎo)致PC12細胞周期阻滯在G0/G1期，而隨著暴露劑量(20、40μg/mL)的增加細胞周期則阻滯在S期，同時伴隨著G2/M期細胞數(shù)的顯著 (4) CuO-NPs致PC12細胞氧化應(yīng)激水平：各劑量水平的CuO-NPs暴露均可造成PC12細胞GSH水平顯著降低；10~30μg/mL劑量暴露組PC12細胞總GSH水平顯著降低；15~30μg/mL劑量暴露組PC12細胞總SOD活性顯著降低，NO含量顯著升高；20~30μg/mL劑量暴露組MDA含量顯著升高，GSH/GSSG比值顯著降低。 研究結(jié)論： (1)3種不同類型的納米材料氣管滴注暴露后，ZnO-NPs和SWCNTs可致腦組織氧化損傷，抗氧化水平降低，清除自由基的能力顯著下降；ZnO-NPs可影響抑制性單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT、5-HIAA和興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu的合成與代謝，SWCNTs可影響DA和興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu、Asp的合成與代謝，SiO2-NPs可影響Glu、Asp的合成與代謝，說明導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷；且ZnO-NPs可對腦組織造成組織病理性損傷，出現(xiàn)炎細胞浸潤。 (2)3種納米金屬氧化物鼻腔滴注暴露后可沿嗅神經(jīng)轉(zhuǎn)運至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激和免疫炎性反應(yīng)發(fā)生，造成腦組織超微結(jié)構(gòu)損傷。氧化應(yīng)激和免疫炎性反應(yīng)可能是納米顆粒引發(fā)神經(jīng)毒性效應(yīng)的主要作用機制之一，符合目前普遍認(rèn)同的PD發(fā)病機制，提示這3種納米顆�？赡軙黾覲D的易感性。 (3)3種納米金屬氧化物可降低細胞活性；通過影響細胞膜的完整性和通透性抑制細胞活性；引起細胞凋亡；通過阻滯細胞周期抑制細胞增殖。同時可引發(fā)多巴胺能神經(jīng)元PC12細胞形態(tài)學(xué)改變，使細胞突起變短，細胞間突起結(jié)點變少甚至消失，提示3種納米顆�？赡芡ㄟ^損傷神經(jīng)元的神經(jīng)突起，導(dǎo)致神經(jīng)細胞間的物質(zhì)運輸和信息傳遞無法正常進行，進而對生物體的神經(jīng)系統(tǒng)功能造成損傷，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。 (4) CuO-NPs可致PC12細胞氧化應(yīng)激水平升高，可能通過氧化應(yīng)激機制引發(fā)PC12細胞毒性作用。并且造成PC12細胞內(nèi)NO的含量急劇升高，提示，CuO-NPs可能會造成多巴胺能神經(jīng)元對DA的代謝異常，進而導(dǎo)致神經(jīng)元的神經(jīng)調(diào)節(jié)功能損傷；另外，NO通過與細胞內(nèi)的超氧陰離子合成強效的氧化劑-過氧亞硝基陰離子，對PC12細胞造成氧化損傷。 (5)3種納米金屬氧化物和SWCNTs可能會增加PD的易感性，是PD的環(huán)境促進因素之一。 (6)3種不同類型的納米材料間比較，無機納米金屬氧化物ZnO-NPs毒性作用最強，碳納米材料SWCNTs次之，無機納米非金屬氧化物SiO2-NPs毒性作用較��；3種納米金屬氧化物間比較， ZnO-NPs的毒性作用最強，CuO-NPs次之，其次是Al2O3-NPs；其差異可能與其結(jié)構(gòu)特征及化學(xué)組成的不同有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 胡大林,廖建坤,吳校連,陳雄飛,夏旭;自由基與DNA的氧化損傷[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);2002年05期

2 李曉波;;納米氧化鋁對神經(jīng)小膠質(zhì)細胞N9的細胞毒性初探[J];環(huán)境與健康雜志;2009年04期

3 黃雌友,文格波,曹仁賢,劉江華;葡萄糖對人血管內(nèi)皮細胞周期和凋亡的影響[J];南華大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2002年04期

4 王云;豐偉悅;趙宇亮;柴之芳;;納米顆粒物的中樞神經(jīng)毒性效應(yīng)[J];中國科學(xué)(B輯:化學(xué));2009年02期

5 崔萌萌;黃俊;王江偉;曹毅;毛彩霞;李巖;;多壁碳納米管對小鼠肺臟和肝臟組織SOD活力和GSH含量的影響[J];生態(tài)毒理學(xué)報;2008年02期

6 張金洋;宋文華;;納米氧化鋅的健康危害與生態(tài)安全性研究進展[J];生態(tài)毒理學(xué)報;2010年04期

7 靳翠紅;金一和;王靜;趙翠霞;;納米和微米SiO_2吸入染毒對大鼠氧化損傷指標(biāo)的比較研究[J];衛(wèi)生研究;2008年01期

8 王翔;鄧小勇;王海芳;劉元方;王天成;顧依群;賈光;;氣管滴注水溶性�；撬�-多壁碳納米管對小鼠肺臟的影響[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2007年02期

本文編號：2777924