【摘要】：環(huán)孢子蟲(Cyclospora)是一種新近出現(xiàn)的食源性傳播,人和動(dòng)物體腸道上皮細(xì)胞寄生,廣泛地引起宿主胃腸炎或腹瀉癥狀的寄生性原蟲。到目前,環(huán)孢子蟲具有20個(gè)種,其中卡耶塔環(huán)孢子蟲(Cyclospora cayetanensis)是唯一感染人體的種類。自1990s以來,人體環(huán)孢子蟲病在世界范圍內(nèi)有大量零星和暴發(fā)感染的報(bào)道,溯源研究顯示與呈地方流行地區(qū)旅游歸來或消費(fèi)受污染的食物有關(guān)。同時(shí),環(huán)孢子蟲的感染具有明顯的季節(jié)性分布(主要發(fā)生在夏季或雨季),且許多腸道寄生原蟲(包括:隱孢子蟲、環(huán)孢子蟲、十二指腸賈第蟲、微孢子蟲、弓形蟲)與生的或未經(jīng)煮熟的蔬菜/水果的食入具有顯著的相關(guān)性。為了解我國河南地區(qū)人體環(huán)孢子蟲的分子流行病學(xué)和卡耶塔環(huán)孢子蟲的群體遺傳結(jié)構(gòu),以及果蔬表面寄生原蟲的攜帶感染情況開展本研究,以期為人體環(huán)孢子蟲傳播方式及其病的防控提供支持。我國卡耶塔環(huán)孢子蟲分離株(n=102)卵囊的平均大小為8.49±0.12μm×8.26±0.12μm,卵形指數(shù)為1.03。河南地區(qū)(鄭州和開封)住院病人環(huán)孢子蟲的分子流行病學(xué)調(diào)查顯示,總體感染率為1.2%(76/6579),各個(gè)年齡段均有環(huán)孢子蟲的感染(P0.05)。在2011-2015年期間,環(huán)孢子蟲的總體感染率呈下降趨勢。本調(diào)查結(jié)果與洪都拉斯醫(yī)院住院病人樣本中環(huán)孢子蟲的感染率(1.3%)類似;而顯著高于墨西哥兒科醫(yī)院病人的感染率(0.67%);低于尼泊爾在校兒童和意大利住院病人的感染率。基于SSU rRNA基因、ITS基因和HSP70蛋白基因的分子種系進(jìn)化分析顯示,所獲得的環(huán)孢子蟲分離株與已報(bào)道的墨西哥,波蘭,中國,尼泊爾和秘魯?shù)目ㄒh(huán)孢子蟲分離株均聚集于同一進(jìn)化分枝。然而,僅依靠單一基因的進(jìn)化分析是不充分或是不可靠的,應(yīng)該檢測多個(gè)基因位點(diǎn),進(jìn)行多位點(diǎn)序列分析。卡耶塔環(huán)孢子蟲陽性分離株(n=76)多位點(diǎn)序列分析(MLST)結(jié)果顯示,環(huán)孢子蟲五個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(CYC3,CYC13,CYC15,CYC21和CYC22)分別成功擴(kuò)增數(shù)為49、59、57、52和56個(gè),共有45個(gè)分離株樣本在五個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均成功擴(kuò)增。微衛(wèi)星位點(diǎn)CYC21顯示比其它位點(diǎn)具有更高的基因多態(tài)性和分辨率。這45個(gè)卡耶塔環(huán)孢子蟲分離株共形成29個(gè)多位點(diǎn)基因型(MLG26-MLG54)。在全球范圍內(nèi)報(bào)道的79個(gè)卡耶塔環(huán)孢子蟲分離株(包括34個(gè)已知分離株的參考序列)共形成了54個(gè)多位點(diǎn)基因型(MLG1到MLG54),29個(gè)單倍型(haplotypes),64個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(polymorphic sites)。環(huán)孢子蟲群體遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示具有顯著但不完全的連鎖不平衡性,且為克隆性群體遺傳結(jié)構(gòu);重組分析顯示存在極少的重組事件數(shù)(Rm=5)。基于環(huán)孢子蟲5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的串聯(lián)序列形成54個(gè)多位點(diǎn)基因型(MLG)的分子種系發(fā)育分析,結(jié)果共產(chǎn)生了3個(gè)主分枝。使用STRUCTURE軟件基于環(huán)孢子蟲五個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因序列圖譜進(jìn)行的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示,ΔK在K=3時(shí)達(dá)到峰值,共形成了3個(gè)亞群。MLST分析方法為卡耶塔環(huán)孢子蟲的群體遺傳學(xué)的研究提供了重要的新視角。蔬菜/水果表面隱孢子蟲卵囊洗脫方法優(yōu)化的研究表明,采取往返振蕩方式,振蕩頻率為100次/min,振蕩時(shí)間為1h(期間每15 min翻轉(zhuǎn)一次),洗脫液采用1%Alconox~?,其總體回收率最高。顯微鏡計(jì)數(shù)分別采用第一次洗脫液和第二次洗脫液之和時(shí),回收率達(dá)到71.40%(31.42×10~4/44.00×10~4)。其回收率高于之前報(bào)道的基于免疫磁珠檢測生菜表面微小隱孢子蟲卵囊的回收率;而低于基于流式細(xì)胞儀檢測,同樣使用1%Alconox~?作為洗滌液的回收率。在商業(yè)化試劑盒提取水溶液中隱孢子蟲卵囊基因組DNA質(zhì)量的比較研究中,土壤DNA提取試劑盒與糞便DNA提取試劑盒提取DNA的質(zhì)與量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異。然而,土壤DNA試劑盒耗時(shí)較短,糞便DNA試劑盒成本較低。綜上所述,本研究部分以生菜為研究對象,優(yōu)化了蔬菜/水果表面攜帶原蟲的洗脫方法,為之后病原攜帶情況的調(diào)查研究提供了技術(shù)支持。我國河南(鄭州和開封)地區(qū)蔬菜/水果表面攜帶寄生性腸道原蟲(隱孢子、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲)的檢測結(jié)果顯示,其總體攜帶感染率為3.8%(42/1099)。其中畢氏腸微孢子蟲感染率最高為3.5%(39/1099),只檢測到少量的卡耶塔環(huán)孢子蟲(n=2)和微小隱孢子蟲(n=1),未檢測到十二指腸賈第蟲的感染。然而,在波蘭蔬菜/水果表面攜帶的微孢子蟲感染率達(dá)到11.3%(9/80),顯著高于本研究(P0.01)。值得注意的是,蔬菜/水果表面感染的微孢子蟲基因型EbpC在中國和美國的人體內(nèi)報(bào)道,顯示其具有較強(qiáng)的人體致病性。本研究中,卡耶塔環(huán)孢子蟲和微小隱孢子蟲分別僅鑒定于生菜,油麥菜和韭菜表面。蔬菜/水果表面攜帶隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲感染的報(bào)道,亦常見于韓國,加納和埃塞俄比亞等國家。這是我國首次進(jìn)行果蔬表面微孢子蟲、卡耶塔環(huán)孢子蟲和微小隱孢子蟲等原蟲攜帶情況的報(bào)道。綜上所述,我國河南地區(qū)住院病人的環(huán)孢子蟲總體感染率較低,MLST分析顯示卡耶塔環(huán)孢子蟲群體具有連鎖不平衡性,且為克隆性群體遺傳結(jié)構(gòu)。同時(shí),本研究優(yōu)化了蔬菜/水果表面攜帶原蟲的洗脫方法,為之后的調(diào)查研究提供了技術(shù)支持。并對河南地區(qū)果蔬表面畢氏腸微孢子蟲,卡耶塔環(huán)孢子蟲和微小隱孢子蟲攜帶感染情況進(jìn)行了報(bào)道。然而,來自于人體和其它來源(動(dòng)物、土壤、蔬菜和水源)MLST數(shù)據(jù)有待深入研究,并對其傳播途徑和風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R155.5
【圖文】：

數(shù)量不定的黑色包涵體；孢子化卵囊內(nèi)含有兩個(gè)孢子囊，且每個(gè)孢子囊內(nèi)含有兩個(gè)子孢子[13]（圖1）。這種環(huán)孢子蟲卵囊常規(guī)的檢測方法具有操作簡單，設(shè)備需求低的特點(diǎn)；但是也伴隨著敏感性低和檢測時(shí)間長等缺點(diǎn)，以及也容易受到工作人員知識(shí)水平和視覺易疲勞的限制，及糞便中假陽性或假陰性雜質(zhì)的影響[12]。2.2 環(huán)孢子蟲卵囊熒光顯微鏡檢測由于環(huán)孢子蟲卵囊壁可在 330～380 nm 的紫外濾光器下卵囊壁自發(fā)藍(lán)色熒光，在 450～490 nm 濾光器下卵囊壁自發(fā)綠色熒光，利用其卵囊的這種特性已經(jīng)在臨床上建立了快速檢測和鑒定環(huán)孢子蟲感染的方法[14]，同時(shí)已經(jīng)應(yīng)用于人體卡耶塔環(huán)孢子蟲的臨床檢測和流行病學(xué)的研究[7]。近些年來，還出現(xiàn)了一種可檢測環(huán)境和臨床樣本中是否存在環(huán)孢子蟲卵囊的流式細(xì)胞術(shù)新方法

3.1 基因位點(diǎn)環(huán)孢子蟲研究中最常用的基因序列有 SSU rRNA[5]和 ITS[18]，以及新近獲得的熱休克 70蛋白（Heat shock 70 kDa，HSP70）基因序列[43]�？ㄒh(huán)孢子蟲（C. cayetanensis）的核糖體 DNA 基因的結(jié)構(gòu)單元示意圖如圖 2。需要特別注意的是，由于 SSU rRNA 基因序列具有高度的保守性，因此基于 SSU rRNA 基因區(qū)分人體卡耶塔環(huán)孢子蟲（C. cayetanensis）或者其它種類環(huán)孢子蟲種的不同分離株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系十分實(shí)用。已經(jīng)有研究者利用環(huán)孢子蟲 SSU rRNA 基因?qū)h(huán)孢子蟲和其它種類的頂復(fù)門寄生原蟲進(jìn)行區(qū)分[19]。另外，分析來源于人類和狒狒源的環(huán)孢子蟲分離株之間的 SSU rRNA 基因序列顯示分別有 0.78%和 0.73%的差異[45]。在另一項(xiàng)研究中顯示，C. papionis，C. colobi，和 C. cercopitheci 的 SSU rRNA 基因與人類的分離株有 0.3～0.6%的序列差異[5]。針對其它種類動(dòng)物體內(nèi)存在的環(huán)孢子蟲樣品的SSU rRNA 基因序列的研究亦在進(jìn)行，主要有非人靈長類和奶牛等動(dòng)物。2010 年報(bào)道，高振永等研究者[29]等根據(jù)猴源環(huán)孢子蟲分離株的 SSU rRNA 基因序列，設(shè)計(jì)了兩對相對保守性引物，并進(jìn)行了不同樣本之間的特異性和敏感性研究。隨后，Li 等研究者[28]對肯尼亞捕獲狒狒的糞便樣本，擴(kuò)增了其 SSU rRNA 基因的部分序列，鑒定的蟲種均為 C. papionis，并對其分離株序列進(jìn)行了種系發(fā)育進(jìn)化分析。

河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆博士研究生學(xué)位論文株的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列（8.3%）比危地馬拉分離株（3.8%）序列差異大。在 1996年，美國環(huán)孢子蟲病暴發(fā)期間獲得的 5 份人源環(huán)孢子蟲分離株的 ITS-1 序列一致，然而在危地馬拉和秘魯?shù)沫h(huán)孢子蟲分離株的 ITS-1 序列差異顯著。共感染和多拷貝也許能解釋不同分離株之間 ITS-1 序列的變異性。人體卡耶塔環(huán)孢子蟲（C. cayetanensis）和狒狒源環(huán)孢子蟲（C. papionis）的 5.8S rRNA 基因已經(jīng)獲得，顯示其不同分離株之間高度的保守性[2]。在 2013年，Sulaiman 等研究者[43]，開發(fā)了一種基于 HSP70 蛋白基因的快速檢測卡耶塔環(huán)孢子蟲（C.cayetanensis）的方法，結(jié)果顯示不同環(huán)孢子蟲分離株之間的 HSP70 基因具有較高的保守性。在另一項(xiàng)研究，基于 SSU rRNA 和 HSP70 基因位點(diǎn)序列顯示，全球范圍內(nèi)不同地區(qū)來源的環(huán)孢子蟲分離株不存在地理隔離[44]。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周洋;王強(qiáng);呂彪;齊萌;菅復(fù)春;張龍現(xiàn);;環(huán)孢子蟲流行病學(xué)、分類及其遺傳特征的研究進(jìn)展[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2009年03期

2 肖淑敏;李國清;周榮瓊;李韋華;;牛源環(huán)孢子蟲的發(fā)現(xiàn)與分子鑒定[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2006年04期

3 李韋華;李國清;肖淑敏;楊建偉;;牛源環(huán)孢子蟲18S rDNA部分序列的擴(kuò)增與克隆分析[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2006年12期

4 肖淑敏;李國清;李韋華;周榮瓊;;牛源環(huán)孢子蟲的形態(tài)學(xué)特征觀察[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2006年08期

5 張曉麗;張唯哲;沈玉娟;劉愛芹;;卡耶塔環(huán)孢子蟲的生物學(xué)和流行病學(xué)研究進(jìn)展[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2012年04期

6 倫照榮,盧力心,陳曉光,李娟;環(huán)孢子蟲(Cyclospora):一種新的人體腸道致病原蟲[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;1997年06期

7 孫芳芳;羅楠楠;李俊強(qiáng);趙金鳳;李廷文;黃建營;張龍現(xiàn);;水果及蔬菜表面環(huán)孢子蟲卵囊檢測方法的建立[J];河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年06期

8 肖淑敏;李國清;周榮瓊;李韋華;;以ITS-1+序列鑒定牛源環(huán)孢子蟲[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2007年01期

9 岳彩玲;李國清;程家林;高振永;朱海波;李結(jié);;犬源環(huán)孢子蟲的ITS-1序列鑒定[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2011年02期

10 程家林;李國清;岳彩鈴;徐前明;高振永;劉霞;;鴨糞中環(huán)孢子蟲18S rDNA部分基因和ITS-1基因的克隆與分析[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 ;中國犬環(huán)孢子蟲的首次發(fā)現(xiàn)(英文)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

2 ;中國鴨環(huán)孢子蟲新種的鑒定(英文)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

3 肖淑敏;李國清;李韋華;周榮瓊;;牛源環(huán)孢子蟲的形態(tài)學(xué)特征觀察[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

4 肖淑敏;李國清;周榮瓊;李韋華;;牛源環(huán)孢子蟲18S rDNA的分子鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

5 肖淑敏;李國清;李韋華;周榮瓊;;牛源環(huán)孢子蟲套式PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

6 肖淑敏;李國清;周榮瓊;李韋華;;以ITS-1~+序列鑒定牛源環(huán)孢子蟲的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

7 肖淑敏;李國清;李韋華;周榮瓊;;牛源環(huán)孢子蟲套式PCR-液相雜交-酶顯色檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

8 李俊強(qiáng);余復(fù)昌;常艷凱;張振杰;王臣榮;崔艷艷;李玉婉;王榮軍;張龍現(xiàn);;卡耶塔環(huán)孢子蟲基于18S rRNA和ITS-1基因的種系發(fā)育分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)分會(huì)第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

9 羅楠楠;余復(fù)昌;王臣榮;李俊強(qiáng);張龍現(xiàn);;河南省鄭汴地區(qū)果蔬表面攜帶原蟲情況調(diào)查[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)分會(huì)第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

10 李國清;肖淑敏;周榮瓊;李韋華;;牛源環(huán)孢子蟲的發(fā)現(xiàn)與分子鑒定[A];提高全民科學(xué)素質(zhì)、建設(shè)創(chuàng)新型國家——2006中國科協(xié)年會(huì)論文集[C];2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 李俊強(qiáng);卡耶塔環(huán)孢子蟲分離株群體遺傳結(jié)構(gòu)特征及常見果蔬攜帶情況研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 肖淑敏;牛源環(huán)孢子蟲與賈第蟲的分子特性與檢測研究[D];華南農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

3 郭亞瓊;隱孢子蟲和環(huán)孢子蟲的全基因組測序及其在分型工具建立中的應(yīng)用[D];華東理工大學(xué);2015年

4 劉世友;三種人獸共患胃腸道原蟲的全基因組測序及比較基因組研究[D];華東理工大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 叢湄湄;陜西省圈養(yǎng)野生動(dòng)物腸道寄生蟲感染情況調(diào)查及其環(huán)孢子蟲、隱孢子蟲種鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

2 孫芳芳;河南省鄭汴地區(qū)水果、蔬菜表面主要腸道原蟲攜帶情況調(diào)查[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2776717