【摘要】：目的:金屬鎳廣泛應用于工業(yè)和人們?nèi)粘Ｉ钪?是導致過敏性接觸性皮炎最常見的過敏原。鎳過敏一旦發(fā)生便可持續(xù)數(shù)年甚至終身,目前對于鎳過敏的治療均只能控制癥狀,無法降低對鎳的過敏性,因此闡明鎳過敏的發(fā)病機制,尋找鎳過敏早期生物學效應指標,對鎳過敏的早期診斷和治療均具有重要意義。本研究首先以鎳暴露工人為研究對象,探索鎳暴露工人外周血淋巴細胞亞群和血清細胞因子的改變,尋找鎳過敏早期生物學效應指標;同時通過構建鎳致敏小鼠模型,檢測鎳致敏小鼠淋巴細胞增殖、活化功能的改變,為鎳過敏的發(fā)病機制提供線索。方法:以整群抽樣的方法,選擇湖北省某電子廠70名鎳作業(yè)工人為暴露組,同地區(qū)某食品廠126名工人為對照組,開展橫斷面分子流行病學研究。通過2.5%和5.0%硫酸鎳斑貼實驗將暴露組分為斑貼陰性組和斑貼陽性組。暴露工廠車間空氣鎳暴露水平經(jīng)乙炔-空氣火焰原子吸收光譜法檢測;暴露工人皮膚鎳濃度經(jīng)電感耦合等離子體質譜法及外標法檢測;尿鎳濃度經(jīng)分光光度計法檢測。EDTA抗凝靜脈血做血常規(guī)分析;外周血淋巴細胞亞群百分比采用流式細胞術檢測,并結合血常規(guī)計算淋巴細胞亞群絕對值。流式液相多重蛋白定量技術檢測血清細胞因子水平。動物實驗以8周齡C57BL/6雌性小鼠為實驗鼠,開展淋巴細胞增殖、活化功能及NK細胞殺傷功能的研究。通過上背部皮內(nèi)注射聯(lián)合背部封閉涂抹致敏、右耳和下背部激發(fā)的方式構建NiS04致敏小鼠模型,通過激發(fā)后48h雙側耳重量之差、激發(fā)后24h和48h耳腫、激發(fā)后48h激發(fā)部位皮膚變化與組織病理變化進行模型評價。激發(fā)后48h取樣進行各指標檢測。其中,脾淋巴細胞增殖的檢測采用EDU滲入法,外周血淋巴細胞亞群分析、脾和淋巴結淋巴細胞活化的檢測采用流式細胞術,脾NK細胞殺傷功能的檢測采用CCK-8法和CFSE/Annectin-V/7-AAD流式三染法;同時取激發(fā)后48h脾單個淋巴細胞體外NiS04共培養(yǎng)24h,進行特異性淋巴細胞增殖和活化功能檢測。所有數(shù)據(jù)通過SPSS Statistics 22.0軟件進行分析。人群研究部分,年齡、BMI、外周血淋巴細胞亞群等指標符合正態(tài)分布,以x±s的形式表示;尿鎳水平×100倍自然對數(shù)轉換、血清MCP-1+3自然對數(shù)轉換后呈正態(tài)分布,以P50(P25,P75)的形式表示,以轉換后的形式用于差異性比較;該2類指標在對照組與暴露組間的差異性比較采用t檢驗;在對照組、低暴露組、高暴露組三組間和對照組、斑貼陰性組、斑貼陽性組三組間的比較采用單因素方差分析,三組間每兩兩組比較采用LSD-t檢驗,趨勢性檢驗采用一般線性模型。血清IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α檢出率均低于50%,該類指標檢出率與吸煙、飲酒在對照組與暴露組兩組間的差異性比較和在對照組、斑貼陰性組、斑貼陽性組三組間的差異性比較采用Pearsonχ2檢驗。血清IL-8、MIP-1β屬于偏態(tài)分布計量資料,以P50(P25,P75)的形式表示;在對照組與暴露組間的差異性比較采用Mann-Whitney U檢驗;在對照組、低暴露組、高暴露組三組間和對照組、斑貼陰性組、斑貼陽性組三組間的比較以及三組間每兩兩組的比較采用Kruskal-WallisH檢驗。暴露組皮膚鎳濃度×100倍自然對數(shù)轉換、暴露工齡×100倍自然對數(shù)轉換呈正態(tài)分布,以P50(P25,P75)的形式表示,以轉換后的形式用于Pearson相關分析,原形式用于Spearman等級相關分析。其中,皮膚鎳濃度與尿鎳水平、總人群尿鎳水平與外周血淋巴細胞亞群等指標、暴露組暴露工齡與外周血淋巴細胞亞群等指標的相關分析采用Pearson相關分析,總人群尿鎳水平與血清細胞因子水平、暴露組暴露工齡與血清細胞因子水平的相關分析采用Spearman等級相關分析。動物實驗研究部分,所有指標均以x±s的形式表示,對照鼠與鎳致敏鼠兩組間的差異性比較及不同濃度培養(yǎng)孔間的差異性比較均采用t檢驗。選用雙側統(tǒng)計學檢驗用于本研究統(tǒng)計學分析,檢驗水準取P0.05。結果:1、分子流行病學研究:鎳暴露工廠車間空氣中鎳濃度范圍為0.0054mg/m3～0.3757mg/m3,低于《車間空氣中鎳及其無機化合物衛(wèi)生標準》(GB16210—1996)規(guī)定的可溶性鎳化合物最高容許濃度0.5mg/m3;暴露組皮膚鎳濃度為0.42(0.23,0.60)μg/cm2,尿鎳水平為13.60(7.35,28.76)μg/L,兩者呈正相關(r=0.332,P=0.012),同時,暴露組尿鎳水平顯著高于對照組6.02(3.93,10.97)μg/L(P0.001)。暴露組斑貼陽性工人共14人,斑貼陽性率20.00%(14/70),證明我國當前標準無法為高敏感個體提供足夠保護。暴露組外周血白細胞、CD4+/CD8'、嗜中性粒細胞分別為7.03±1.67×1O9/L、1.68±0.72、4.54±1.45×109/L,顯著高于對照組(6.23±1.35×109/L、1.27±0.43、3.7J±1.07× 1 09/L)(P0.05),CD8+T 細胞、NK 細胞和血小板分別為 0.52±0.26× 1 09/L、0.34±0.18×109/L、200.66±69.01×109/L,顯著低于對照組(0.60±0.22×109/L、0.45±0.25× 1 09/L、229.85±51.48× 1 09/L)(P0.05)。暴露組血清 IL-4 檢出率為 10.00%,顯著低于對照組(51.61%)(P0.001):IL-8 水平為 6.70(5.61,9.61)pg/mL,顯著低于對照組[10.45(4.62,40.90)pg/mL](P=0.001);MIP-1β 水平為 51.72(27.43,79.29)pg/mL,顯著高于對照組[33.66(17.32,55.97)pg/mL](P=0.001),提示低濃度鎳暴露可致作業(yè)工人血常規(guī)指標、淋巴細胞亞群及血清細胞因子發(fā)生改變。相關分析結果顯示:全人群尿鎳水平與外周血白細胞(r=0.244,P=0.001)、CD4+/CD8 +(r=0.177,P=0.015)、嗜中性粒細胞(r=0.285,P0.001)呈正相關,與血清IL-8(r=-0.150,P=0.040)呈負相關;按暴露組尿鎳水平中位數(shù)(13.60μg/L)將暴露組分為低暴露組(尿鎳≤13.60μg/L,n=35)和高暴露組(尿鎳13.60μg/L,n=35)后,低暴露組白細胞、CD4+/CD8+、嗜中性粒細胞分別為6.89±1.89×109/L、1.64±0.68、4.35±1.51×109/L,高暴露組分別為 7.16±1.44×109/L、1.72±0.77、4.73±1.39×109/L,均顯著高于對照組(6.23±1.35×109/L、1.27±0.43、3.71±1.07×109/L)(P0.05);血清 IL-8在低、高暴露組分別為 6.90(5.51,6.90)pg/mL 和 6.59(5.93,8.43)pg/mL,均顯著低于對照組[10.45(4.62,40.90)pg/mL](P0.05)。提示外周血白細胞、CD4+/CD8+、嗜中性粒細胞和血清IL-8等4項指標對鎳暴露更敏感。尚未發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細胞和血清細胞因子與工齡的相關關系(P0.05)。鎳暴露組中斑貼陽性組尿鎳水平為13.66(7.71,30.04)μg/L,與斑貼陰性組[10.82(2.46,31.05)μg/L]差異無統(tǒng)計學意義(P=0.513);斑貼陽性組外周血淋巴細胞、T細胞分別為1.69±0.42×109/L、1.12±0.28×109/L,均同時顯著低于斑貼陰性組(2.08±0.67×109/L、1.45±0.51×109/L)和對照組(2.10±0.51×109/L、1.41±0.38×109/L)(P0.05),血清 MCP-1 為 116.49(48.76,147.80)pg/mL,顯著高于斑貼陰性組[57.03(37.43,85.85)pg/mL](P=0.002)和對照組[58.07(47.21,73.25)pg/mL](P=0.008),但斑貼陰性組和對照組該3項指標差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),提示該3項指標可能作為篩選鎳過敏的早期生物學效應指標。2、動物實驗研究:鎳致敏鼠激發(fā)后48h雙側耳重量之差、激發(fā)后24h和48h耳腫分別為5.00±3.81mg、0.05±0.04mm、0.06±0.03mm,均顯著高于對照鼠(-0.17±1.47mg、0.00±0.01mm、0.01±0.01mm)(P0.05);鎳致敏鼠激發(fā)后48h激發(fā)耳毛細血管充血、皮膚微紅,背部激發(fā)處皮膚與對照鼠無明顯差異;鏡下可見鎳致敏鼠激發(fā)耳及背部激發(fā)處皮膚炎性細胞浸潤程度較對照鼠明顯。提示鎳致敏小鼠模型雖尚未出現(xiàn)肉眼可見的典型超敏反應皮炎,但對致敏原已產(chǎn)生了可檢測的免疫應答反應,可認為遲發(fā)型超敏反應形成。鎳致敏鼠外周血白細胞、B細胞分別為4.62±1.10×109/L、0.82±0.31×109/L,顯著低于對照鼠(6.10±0.93×109/L、1.43±0.46× 109/L)(P0.05),結合鎳致敏鼠激發(fā)部位皮膚組織出現(xiàn)的炎性細胞浸潤,推測該結果可能由于鎳致敏鼠外周血細胞向激發(fā)部位遷移所致;鎳致敏鼠脾T細胞、CD8+T細胞增殖百分比分別為(1.51±±0.26)%、(0.59±0.11)%,顯著高于對照鼠[(1.16±0.22)%、(0.42±0.11)%](P0.05),提示鎳CD8+T細胞可能參與鎳致過敏性接觸性皮炎的形成;鎳致敏鼠脾淋巴細胞CD69表達率為(0.80±0.24)%,顯著低于對照鼠[(1.58±0.32)%](P=0.001),CD44 的表達率在兩組間無明顯差異,但鎳致敏鼠淋巴結中淋巴細胞CD44表達率為(70.95±3.31)%,則顯著高于對照鼠[(60.23±4.96)%](P=0.001),提示鎳致敏鼠淋巴結部位的淋巴細胞發(fā)生活化;鎳致敏鼠脾NK細胞對YAC-1細胞的殺傷率(%)與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。鎳致敏鼠與對照鼠脾淋巴細胞經(jīng)NiSO4體外共培養(yǎng)24h,對照鼠15μg/mLNiSO4培養(yǎng)孔CD8+T細胞和NK細胞分別為2.00±0.89、2.00±1.67,顯著低于0μg/mLNiSO4培養(yǎng)孔(4.33±0.58、5.67±1.53)(P0.05),提示 NiS04對 CD8+T 細胞和 NK 細胞存在毒效應,這與本研究第一部分發(fā)現(xiàn)鎳暴露工人外周血CD8+T細胞和NK細胞下降一致;鎳致敏鼠15μg/mLNiS04培養(yǎng)孔T細胞和CD4+T細胞增殖數(shù)分別為33.07±6.32、24.47±5.25,顯著高于0μg/mLNiSO4培養(yǎng)孔(19.50±4.80、14.50±1.91)(P0.05),提示鎳致敏鼠產(chǎn)生鎳特異性T細胞和CD4+T細胞;而鎳致敏鼠CD8+T細胞在15μg/mL NiSO4培養(yǎng)孔為9.50±3.62,雖高于對照孔4.91±2.49,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),可能由于體外NiSO4共培養(yǎng)時,CD8+T細胞對鎳的特異性免疫增殖效應無法完全掩蓋鎳的毒效應所致。結論:1、低濃度鎳暴露可致作業(yè)工人出現(xiàn)血常規(guī)指標、外周血淋巴細胞亞群及血清細胞因子水平的改變,其中,白細胞、CD4+/CD8+、嗜中性粒細胞、IL-8等指標對鎳暴露更為敏感;2、外周血淋巴細胞、T細胞,以及血清MCP-1可能作為篩選鎳過敏人群的早期生物學效應指標;3、CD4+T細胞和CD8+T細胞均參與鎳致ACD的形成,但鎳對CD8+T細胞同時存在明顯的毒效應。
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R135
【圖文】：

物學效應指標；斑貼陰性組外周血ＣＤ４＋Ｔ細胞為０．８１±０．３０ｘｌ０９／Ｌ，顯著高于斑貼陽逡逑性組（０．６３±０．２２ｘｌ0９／Ｌ）邋００．００４）和對照組（０．７０±０．２0ｘｌ0７Ｌ）邋（Ｐ＝０．０１４），而斑貼逡逑陽性組與對照組外周血ＣＤｆＴ細胞差異無顯著性（Ｆ＞０．０５），見圖１－４。逡逑ｒ—Ｐ＝０．００８逡逑？邐Ｐ＝０．００９邐５１邐１邐１逡逑５１邐｜邐：邐１邐尸＝０．０１３逡逑＾邋４－邋＾邋－邋１邋：＇逡逑ｘ邐４邐ｘ逡逑ｉ邐？：丨益：？奐邐，邐ｓ邋３＇逡逑Ｉ，邋Ｔ邋Ｔ邋＾邋ｆ，琴擎邋ｊ逡逑ｉ邐Ｈ逡逑0Ｊ邐．邐．邐１邐邋0Ｊ邐１邐１邐．邐逡逑刈Ｈｕｍ執(zhí)粘RG對照ｍ諛粘削？川斑阽ｍｎｍ逡逑（ｎ＝１２６）邋（ｎ＊＊５６）邋（ｎ＝１４）邐（ｎ＝邋１２６）邋（ｎ＂＊５６）邋（ｎ＝邋１４）逡逑Ｐ＝０．００４逡逑Ｉ邐Ｉ逡逑Ｐ＝０．０１４逡逑２．０Ｉ邐Ｉ逡逑?邐＂逡逑ｘ邐１．５－邐１逡逑－邐▲逡逑｜邋１0＇暴：蠢逡逑ｐ邋０５－邐＾邐－Ｎ＊１逡逑°邋ｏ．ｏ邐．邐．邐，邐逡逑對照ｍ諛ＷＡｍ約丨斑咕ｗｍ：ｉｉＬ逡逑（ｎ＝邋１２６）邋＜ｎ＊？５６）邐（ｎ＝邋１４）逡逑圖１－４對照組、斑貼陰性組、斑貼陽性組外周血淋巴細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４；Ｔ細胞比較逡逑２．８斑貼陽性組與斑貼陰性組血清細胞因子的比較逡逑斑貼陽性組與斑貼陰性組血清細胞因子水平的比較發(fā)現(xiàn)，斑貼陽性組血清ＭＣＰ－１逡逑水平為丨邋１６．４９邋（４８．７６

３討論逡逑職業(yè)性過敏性接觸性皮炎（Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ邋ａｌｌｅｒｇｉｃ邋ｃｏｎｔａｃｔ邋ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＯＡＣＤ）為我逡逑國法定職業(yè)病，硫酸鎳是引起ＯＡＣＤ常見的過敏原。我國《工作場所空氣中鎳及其逡逑化合物的測定方法（ＧＢＺ／Ｔ１６０．１６—２００４）》規(guī)定乙炔－空氣火焰原子吸收光譜法為工逡逑作場所空氣中鎳及其化合物濃度的測定方法，當前《車間空氣中鎳及其無機化合物Ｒ逡逑生標準》（ＧＢ１６２１０—丨９％）曾規(guī)定（按Ｎｉ計）可溶性鎳化合物最高容許濃度為逡逑０．５ｍｇ／ｍ３，金屬鎳及難溶性鎳化合物為ｌｍｇ／ｍ３，該標準的提出屯要廟十鎳的般山；逡逑性，不能保護感受性高的人員免受鎳的致敏作用［５７］。國外大部分國家＃５８］規(guī)定車間逡逑空氣中可溶性鎳化合物的職業(yè)接觸限值為０．１ｍｇ／ｍ３，遠低于我國標準。德國技術參逡逑３１逡逑

EDU澄入法結合流式細胞術檢測脾琳巴細胞增殖百分比;^:對段鼠脾淋巴細胞:B:鑲致敏鼠脾淋巴細胞

【參考文獻】

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1 趙顯莉;刁穎;賀銀麗;徐艷峰;郭s

本文編號：2744502